基于静电吸引层层自组装技术的生物相容性pla材料制备

基于静电吸引层层自组装技术的生物相容性pla材料制备

作为一种生物分解的聚吡咯酸钠（pla），它被用作骨折固定、药物释放系统、外科缝线、软骨组织工程支架和人工皮革工具。由于pla非常薄，表面可以下沉，而且表面上没有可识别细胞，因此无法有效地支持和促进细胞的生长和分化。为了改善聚吡咯材料的细胞相似性，已经采用了各种表面重建技术，如微带、离面、表面切开术等。为了改善聚吡咯材料的细胞相似性，lbl自我重组技术广泛应用于生物传感器、分离或分析、非线性光学设备、材料表面装饰、高电密度电池、微妙电子变化和空微胶囊等领域。对于lbl制备多层膜的方法，它不仅具有一般应用、操作简单、膜稳定性和机械稳定性的优点，而且在聚吡咯材料表面的形成中对薄肉骨骼（cs）和软骨（cs）的反应能力方面没有严格要求。这些特点决定了lbl技术在组织材料表面装饰方面的重要作用。然而，该技术主要集中在石英、云母、玻璃、金属丝等模型表面，并直接将硫酸钠（cs）和沉积物放入pla表面。硫酸醇（cs）是动物细胞外基质的主要成分。广泛存在于人类和动物疾病的淋巴结（皮肤、肌腱、骨骼和软骨）。细胞外基质通过细胞骨架或各种信号格向细胞转化信号，这对基本生活活动的基本活动（如生命活动、形态、功能、代谢、分工和转移等方面的含量具有很大的影响。这些物质和沉积物在酸性条件下具有正电性。因此，添加二甲基化合物和二甲基化合物的表面可能可以提高pla材料细胞的兼容性。添加二甲基化合物和粘土。1带正电型的耐药剂将3gPLLA(自制,Mn=200000,Mw=400000)溶于100mL1,4-二氧六环中,并浇铸于直经为8cm的不锈钢或玻璃模具上,于35℃干燥24h,转入真空烘箱(30℃)干燥至恒重,得到约100μm厚的半透明PLLA平面膜.将其剪裁成2cm×2cm大小,浸入体积比为1∶1的乙醇-水中浸泡2～3h,以去除表面粘附的油脂和其它杂质.用水充分漂洗后,再浸入一定浓度的1,6-己二胺-正丙醇溶液中,于58℃下反应3min,用水充分漂洗除去未反应的己二胺,于30℃真空烘箱中干燥至恒重.将胺解PLLA膜于室温下在0.012mol/L盐酸溶液中酸化15min,用大量三蒸水冲洗以去除表面吸附的盐酸.将酸化膜在CS(A型,Sigma公司)溶液(1.0mg/mL,0.5mol/LNaCl)中浸泡20min,以吸附一层CS,并使PLLA表面带上负电,用含0.5mol/LNaCl的三蒸水冲洗3次以去除多余的CS.然后浸入到1.0mg/mL胶原(Ⅰ型,Sigma公司)/乙酸溶液(0.1mol/LHAc,0.2mol/LNaCl)中浸泡20min,使PLLA表面吸附一层带正电的胶原;先用0.6%的乙酸溶液(含0.2mol/LNaCl)冲洗,再用含0.2mol/LNaCl的三蒸水冲洗以去除多余的胶原,重复上述步骤,可制备理想层数的CS/胶原多层膜,然后将膜在30℃真空烘箱中干燥至恒重.在胺解PLLA膜上共组装17层CS和胶原,其中第4层均为荧光素异硫氰酸酯标记的多聚赖氨酸(FITC-PLL,Sigma公司)作为能量转移的给体,第6,8,10,14层分别为罗丹明异硫氰酸酯标记的胶原(Rd-胶原)替代普通胶原.在荧光光谱仪(F-4500,HITACHI,室温,激发波长为469nm)上测试从FITC(给体)到Rd(受体)的能量转移情况,用紫外-可见分光光谱仪(CARY100BIO,America,室温)跟踪CS和胶原的层层组装过程.人体脐带静脉内皮细胞按文献方法消化分离,并种植于底部平铺有聚合物膜的96孔组织培养级聚苯乙烯(TCPS)培养板中.培养液为RPMI1640和小牛血清.种植密度为12×104/cm2,每孔接种200μL,将培养板置于37℃的5%CO2培养箱中培养24h,而后隔天换培养液.粘附率(12h)、培养4d后的细胞增殖率和活性按文献方法测定.内皮细胞培养4d后,将培养板中的培养液吸弃,用PBS洗3次,加入2.5%戊二醛或1.0%多聚甲醛200μL,于室温下固定30min.在SEM观察前,用三蒸水清洗经戊二醛或多聚甲醛固定的膜片表面数次,再依次用体积分数为50%,70%,80%,90%,100%乙醇-水梯度溶液浸洗使内皮细胞脱水,每次分别浸洗10～20min,进行SEM[StereoScan260(Cambridge)]形貌观察.2结果与讨论2.1物理吸附和组装层对比用紫外-可见吸收光谱对组装过程进行跟踪.将胶原分子用罗丹明异硫氰酸酯标记(Rd-胶原),利用罗丹明基团在约560nm处的吸收跟踪层层自组装过程(图1).空白PLLA物理吸附Rd-胶原后,在562nm处有吸收(图1中箭头所指),其吸收强度与组装一层Rd-胶原时相近.随着组装层数的增加,吸收峰强度也随之增加,即组装层的厚度增加,增加趋势开始(2～7双层)呈线性增加(除第一层外),而后增加趋缓.这一变化趋势与文献报道的基本一致.第一层的不规则可能由PLLA膜表面的缺陷如粗糙度或小孔等因素引起.后期增加趋缓可能是因为在组装几层以后,次外层分子在继续组装时有所脱落,或者是由于分子层之间的相互穿叉(Interpenetration)导致表面净带电量下降所致.2.2罗丹明发射谱线b上述组装过程通过荧光激发和发射之间的能量转移技术得到进一步证实.由图2可见,因为样品中没有Rd-胶原层,因此图2谱线a即为FITC的发射峰(激发波长为469nm).这一发射峰可作为罗丹明的激发波长,因此在谱线b,c,d和e中出现了罗丹明的发射峰;而谱线b的样品中能量转移效率最高.随着给体与受体之间的距离逐渐增大,能量转移的效率逐渐降低,谱线e给体与受体之间相隔10层时,转移效率已非常低.给体与受体之间距离的增加是荧光能量转移效率降低的主要原因.另外,随着组装层数的增加,每个组装层的厚度趋于减小也会导致能量转移效率的降低.图2中箭头所指处为剩余FITC的荧光发射峰.上述结果均证明了在胺解PLLA表面上确实发生了硫酸软骨素(CS)和胶原的交替组装.由于硫酸软骨素和胶原都是具有良好细胞相容性的生物大分子,这两种物质在PLLA表面的引入有望提高PLLA材料的细胞相容性.2.3表面改性对材料表面活性的影响通过内皮细胞的体外培养研究该LBL改性的PLLA的细胞相容性(图3和4).图3是在光学倒置显微镜下用血球计数板测得的细胞粘附率(12h)、增殖率和活性(4d后)随PLLA表面性能的变化.未改性的PLLA(图3样品b)表面内皮细胞虽具有一定的粘附率,但其增殖率和活性均较低,说明PLLA本身并不能有效支持内皮细胞的生长.在组装一层CS后,细胞的粘附率基本没有增加,但增殖率有一定程度的提高;在进一步组装胶原后(图3中的c,d,e),细胞的粘附率、增殖率和活性都得到了明显改善,而且表面只要组装1双层CS和胶原(以胶原为最外层)后,就足以改善PLLA的细胞粘附率、增殖率和活性,与组装3或者7双层的CS和胶原(以胶原为最外层)的PLLA相近.细胞的形态和功能之间有着密切的关系,细胞形态的好坏直接影响细胞的分化、基因表达及细胞外基质的分泌等.内皮细胞是血管内壁的单层扁平细胞,铺展充分,对于体外培养的内皮细胞也必须充分铺展于材料表面才能很好地生长.图4是内皮细胞在改性前后PLLA上体外培养4d后,在SEM下的细胞形貌.显示内皮细胞在未改性的PLLA膜表面上[图4(A)]细胞完全不能铺展,细胞尺寸明显偏小,培养4d后幸存的很少.细胞铺展是细胞骨架结构的综合表现,是细胞外基质各成分与细胞表面各自的特异性受体结合后通过不同的附着蛋白质(如粘着斑蛋白、α辅肌蛋白等)与细胞骨架成分相连并影响细胞骨架重组的结果,因此细胞粘附和铺展与细胞的功能活动密切相关.细胞的形状还影响细胞的增殖,大多数正常真核细胞在球形