代谢组学技术在中医药研究中的应用

代谢组学技术在中医药研究中的应用

21世纪，对生命的复杂性和完整性的研究已成为生命科学的发展趋势。中医药理论作为传统文化的瑰宝,是立足于人的整体,以司外揣内、整体辨证的思维方式,从整体、功能、动态的角度认识疾病而形成的复杂理论体系,其应用价值已被中医学的临床实践充分证明。近年随着系统生物学的发展,中医药复杂理论体系的科学价值和丰富内涵亦不断被人们认识和揭示。但是,目前仍缺乏合适的现代科学表达体系来全面深入阐释中医药这一复杂的理论体系。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,是系统生物学的重要组成部分。作为后基因时代一种全新的组学技术,代谢组学强调把人体作为一个完整的系统来研究,通过测定人体各种体液内代谢物的组成变化来认识和反映人体代谢网络在疾病和药物作用下的变化规律。在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点,对于揭示复杂性疾病的机制和药物的代谢模式具有独特的优势。应用代谢组学来认识疾病过程,与中医的整体观、系统观和辨证论治思维方式不谋而合,从而给中医药复杂理论体系的研究提供了新的思路和研究平台。代谢组学的基本原理代谢组学是研究生物体系受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学,所关注的是代谢循环中分子量1000以下的小分子代谢物的变化,包括糖、脂质、氨基酸、维生素等,反映的是外界刺激或是遗传修饰下细胞或组织的代谢应答变化。其概念最早来源于代谢轮廓分析,经过不断发展,Fiehn,Allen,Nielsen和Oiver,Villas-Boas等确定了代谢组学的4个层次:第1个层次为代谢物靶标分析(metabolitetargetanalysis),目标是定量分析一个靶蛋白的底物和/或产物;第2个层次为代谢轮廓分析(metabolicprofilinganalysis),采用针对性的分析技术,对特定代谢过程中的结构或性质相关的预设代谢物系列进行定量测定;第3个层次为代谢指纹分析(metabolicfingerprintinganalysis),不分离鉴定具体单一组成,定性并半定量分析细胞外、细胞内全部代谢物(如表型的快速鉴定);第4个层次为代谢组学(metabonomics),定性和定量分析一个生物系统全部代谢物。完整的代谢组学分析的流程包括样品的制备、数据的采集和数据的分析及解释。其样品主要是尿液、血浆或血清、唾液,以及细胞和组织的提取液。样品的制备包括样品的提取、预处理和化合物的分离。样品通常用水或有机溶剂甲醇、乙腈等提取。分析之前,样品常先用固相微萃取、固相萃取或亲和色谱等预处理。核磁共振(NMR)、色谱-质谱联用等是最常用的分析方法。随着电喷雾等软电离技术的出现,质谱联用亦越来越多地应用于代谢组学的研究中,如气-质联用(GC-MS,GC-QTOF-MS-MS)、液-质联用(LC-MS,UPLC-MS,UPLC-MS-MS)、电泳-质谱联用(CE-MS)和等离子体质谱(ICP-MS)等联用技术。但无论采用哪种分析技术,代谢组学都要处理海量的原始数据信息,通过统计学处理,充分抽提数据中的潜在信息,解读数据中蕴藏的生物学意义,这是代谢组学研究的关键内容。目前用于代谢组学研究中的数据处理方法主要有主成分分析(principalcomponentsanalysis,PCA)、非线形映射(nonlinearmapping,NLM)、簇类分析(hierarchicalclusteranalysis,HCA)等非监督(un-supervised)方法和SIMCA(softindependentmodelingofclassanalogy)、PLS-DA(PLSdiscriminantanalysis)、ANN(artificialneuralnetwork)等有监督(supervised)方法。代谢组学与中医藏象学中医藏象学是研究内在的生命本质与外在现象的关系,揭示脏腑与形体诸窍、自然环境关系的学说。“藏”是藏于体内的脏腑,外不可见;“象”是形见于外的生理病理现象,是可见的表现,可预测的征兆。不同脏腑表现出来的生理现象是机体在不同环境下的代谢结果的集中体现。换言之,藏象就是通过外在可见形象研究内在不可见事物的方法。而代谢组学正是通过对体内代谢产物和代谢网路的变化,推断机体受到各种外界因素影响后的最终结果。如Brindle等仅用几滴血液对36例严重心血管疾病患者和30例心血管动脉硬化患者进行了代谢组学分析,结合各种生物信息学技术实现了对心血管疾病及其严重程度的判别,得到了高于90%的灵敏度及专一性。因此,藏象通过外在可见形象研究内在不可见事物的思维方法,与代谢组学由内源性代谢产物反映人体在疾病和药物作用下变化规律的研究思路有着相似之处。将代谢组学的研究方法应用于中医藏象理论,有助于诠释中医药理论科学内涵,促进中医药理论揭示人体生命活动的变化规律。目前已有利用代谢组学研究“脾在液为涎”等中医藏象学说的相关课题正在开展。本课题组利用代谢组学技术,正在展开“肺与大肠相表里”理论的研究。笔者应用炎症性肠病(大肠湿热)大鼠模型,通过NMR、LC-MS/MS代谢组学技术,分析模型组与正常组大鼠尿中小分子代谢物,并通过PCA多变量统计分析,观察到大肠湿热动物模型尿液中醋酸、肌酸、半胱氨酸、乳酸、牛磺酸、二甲胺、丁酸、乙酸、甲胺、三甲胺水平以及氨基酸含量,与正常动物相比存在明显差异,从而初步揭示了肺与大肠相联系的生物学基础。同时,笔者将基于LC-MS方法的代谢组学技术平台应用于对慢性阻塞性肺病(痰热阻肺)动物模型的研究中,发现正常组和模型组之间肺、大肠中的内源性代谢产物也有明显改变,两组能进行有效区分。因此,通过代谢组学技术,从生理、病理状态下内源性物质的比较上,部分揭示了中医“肺”与“大肠”作为综合系统病理相关性的物质基础。代谢组学研究中医认为,证是对机体在疾病发展过程中的某阶段病因、病理、病机、病位的概括。它是中医对疾病某一阶段的特定病理生理过程的认识,是在机体内因和环境外因综合作用下机体的整体状态,并随着病程的发展而发生相应变化。中医证是一个多因素参与的、多层次的、具有整体性的复杂系统,面对的是复杂生命现象的功能层面、整体层面、动态层面,具有典型的开放性、层次性、涌现性和高维性特征。从系统生物学的角度认识中医的证可能是包括基因、蛋白在内的人体生化调节网络变化后所处的一种特异性的、在一定时间内相对稳定的生理状态,即一种特征性生理表型。该特征性表型很可能通过其分泌到血液或尿液中的内源性成分(蛋白和小分子代谢物)的表达谱的改变而客观地反映出来。因此,用现代分析技术捕捉到这些细微的变化,获得偏离出正常范围的特征性代谢表达图谱,可能正是中医证的物质基础以多维多息图谱的形式在代谢物水平上的反映。目前国内学者已通过代谢组学技术研究了部分中医证候的代谢表达谱变化。如陆益红等开展了基于GC/MS、GC-TOF/MS高血压辨证分型的代谢组学研究,结果发现其代谢谱能有效区分痰湿壅盛、肝阳上亢及阴虚阳亢3种证型。朱萱萱等开展了基于GC-TOF/MS冠心病辨证分型的血清代谢组学研究,发现代谢谱能有效区分疾病组和健康对照组,且男性患者中气虚血瘀型和痰阻心脉型可明显区分;女性患者中气虚血瘀型、痰阻心脉型和气阴两虚型可明显区分。王广基等运用代谢组学方法研究不同中医证型冠心病间的血浆代谢物变化规律,发现痰阻心脉和气阴两虚2种证型间多个内源性代谢物的含量存在明显差异,并可能与能量代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢异常相关。从而证明了代谢组学研究手段在揭示中医临床证本质研究中的可行性。罗和古等利用1HNMR技术,初步发现肝郁脾虚证模型大鼠的生物标志物为醋酸酯、乳酸、酪氨酸、LDL。徐舒等运用1HNMR技术发现“肝郁证”大鼠模型,与对照组相比,血浆中葡萄糖(Glucose)和肌酸(Creatine)的含量明显偏高,而3-羟基丁酸(3-hydroxybutyricacid)、谷氨酰胺(glutamine)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、磷酸胆碱(cholinephosphate)和不饱和脂肪酸(unsaturatedfattyacid)的含量明显偏低,以上差异小分子物质构成“肝郁证”的代谢标志物群,成为肝郁证代谢水平的物质基础,有助于阐释肝郁证的本质。刘树民等以2,4-二硝基苯酚诱导的热病证候模型为切入点,借助代谢组学平台,通过对对照组及模型组大鼠尿液的代谢指纹数据及模型组不同时间段尿液的代谢组进行分析,结果表明2,4-二硝基苯酚诱导的动物模型符合中医临床的热病证候表征。简维雄等运用GC-MS法对心血瘀阻证大鼠血浆的代谢产物进行研究,发现改变的乳酸(lactate)、丙氨酸(lactamine)、缬氨酸(valine)、琥珀酸(succinicacid)、苹果酸(malicacid)、硬脂酸(stearicacid)、花生四烯酸(arachidonicacid)、果糖(fructose)等8种代谢物与反映“血瘀”病理的血液流变学指标的改变具有一致性,有可能作为心血瘀阻证代谢性生物标志物。由此说明,基于代谢组学技术在揭示中医证本质上有着广泛的应用前景。代谢组学研究方中药复方是中医临床用药的主要形式,它是以中医辨证论治、藏象学说、阴阳五行学说为指导,按照君臣佐使的组方原则,选用恰当的药物定量配伍而成。中药复方因药味多,成分复杂、成分间协同作用及炮制、煎煮过程中发生的化学反应等因素的影响,使得复方药效和作用机制具有复杂的非线性特征,表现出多成分、多层次、多靶点、多代谢途径的特点。它不仅体现了传统医药对人体复杂系统的认识,其本身也是一个复杂化学成分系统。代谢组学作为研究人体复杂系统的方法,它所具有的非破坏性、整体性、动态性、非靶向等特点,使其适合研究中药复方引起的内源性代谢物的变化,通过检测获得体液的“代谢指纹图谱”和分析引起代谢谱变化的原因,可以整体评价中药复方对机体的生物效应药效和毒理作用,从而阐释中药复方的作用靶点、配伍机制,发现效应物质基础,指临床个体化治疗应用。因此,中药复方在代谢组学的研究方法下将可能得到充分的展示和“挖掘”。王喜军通过代谢组学方法研究健康人群口服六味地黄丸后代谢网络的改变,发现六味地黄丸调节有关的主要代谢途径包括三羧酸循环、肠道生物群、唾液酸生物合成,从一个新的角度阐明了六味地黄丸的传统作用机制,并从生物体代谢角度首次揭示了六味地黄丸的某些潜在作用机制。蒋宁等基于NMR的血清代谢组学研究技术,发现六味地黄丸及八味地黄丸能对有速老龄化小鼠模型(SAMP8)有干预调节作用,对葡萄糖、胆碱和脂类等生物标记物群有改善作用,提示二者可改善SAMP8小鼠的能量代谢障碍及学习记忆能力。BaogangXi等通过代谢组学方法,观察正常的大鼠和灌胃给予六味地黄丸的角叉菜胶所致炎性模型大鼠的尿液代谢谱的变化,结果显示六味地黄丸可以修复被炎症破坏的代谢网络,而具有明显的抗炎作用。贾伟课题组针对左金丸的抗癌作用及人参皂苷对应激模型的干预作用进行了整体药效作用的代谢组学评价。这些研究工作表明,代谢组学作为一种系统性的、整体性的研究方法,能够较全面地揭示中药及其复方治疗疾病过程中生物体系内所发生的一系列生物化学变化,将这些变化与传统手段的测定结果相联系,能够评价药效作用和发现药物作用的物质基础和作用机制。般资料及分析方法体质是指人体生命过程中,在先天禀赋和后天获得的基础上所形成的综合的、相对稳定的特殊状态,这种特殊状态往往决定着其对某种致病因子的易感性及其所产生病变类型的倾向性。体质受“先天”条件以及“后天”因素的影响,环境因素如饮食状况、气候变化以及情绪等心理和社会因素均会影响人体体质。通过代谢组学研究表明,体内外各种因素的变化,会对人体的代谢产物产生潜移默化的影响。如Lenz等收集了给予标准饮食的12名健康男性与相隔14d的血浆和尿液进行NMR代谢组学技术检测,结果发现血浆的差异很小,但在尿液中存在很大的个体差异,同时发现所有受试者代谢谱存在昼夜变化规律。他们还比较了不同国家之间人群的代谢谱的差异情况,研究结果表明:内源性尿代谢谱受到文化、饮食的严重影响。因此,借助代谢组学可以为研究个体体质状况提供更全面的科学依据。此外,体质与人体的心理状况密切相关,这也是中医“形神合一”思想在中医体质理论中的具体体现。薛黎明等已开展了基于NMR分析对抑郁患者和正常人的尿样代谢组学研究,结果发现,抑郁组和正常组的数据能得到有效区分。中医体质学认为,体质的特征伴随着生命活动的全过程,该过程具有循着某种体质类型固有发展的演变规律以及缓慢衍化的趋势。这就使得体质具有可预测性。因此,根据人体体质状况,见微知著,及早预防,“既病防变”这是中医“治未病”的内容之一。代谢组学能通过观察内源性代谢物的种类和数量变化,寻找到相对应的生物学标志物簇(biomarkerclusters),结合从“未病”到“已病”这一病理衍变进程进行相关研究,获得“欲病”时代谢物异常的确切依据,在疾病发病之前即可采取有效的预防措施。因此,借助代谢组学研究个体体质状况为“不治已病治未病”提供了科学依据。研究发现,偏头痛患者在先兆期和发病期都会出现5-HT、前列腺素、神经肽等一系列内源性物质的异常。因此,代谢组学可以通过对这一系列的内源性物质的监控达到预防疾病的目的。当前代谢组学研究的局限性从哪里来?在中医药复杂理论体系中医学是生命科学的一个重要组成部分,整体观、动态观、辨证观是中医理论的特色。中医学研究的核心问题是要通过中医药理论和现代科技相结合,研究揭示中药(扰动体系)与机体(应答体系)两个复杂系统之间相互作用的规律。代谢组学是把人体作为一个完整的系统,研究人体代谢网络在疾病和药物作用下的变化规律,由于代谢组学与中医基本理论和诊疗思