基于多层面生物标志物群的中医临床系统生物学研究体系的构建与应用

基于多层面生物标志物群的中医临床系统生物学研究体系的构建与应用

一、化学组学与系统生物学如何构建符合中国国际惯例和规则的现代研究方法体系是作者长期以来的研究和研究问题。1997年首先提出并发表了中药复方有效部分理论，进而构建了中药化学研究体系，即“一个结合（化学研究与药效学研究相结合）、两个基本讲清（基本讲清药效物质基础，基本讲清作用机理）、三个化学层次（复方整体、有效部分、有效成分）、四个药理水平（整体动物、器官组织、细胞亚细胞、分子生物学）”（简称为“一二三四”研究体系）。即将中药化学物质体系的特点与后基因组时代“组学”研究思想相结合，创建了化学物质组学（Chemomics）新方法。将作用于生物体系的某一个外部扰动体系的所有化学物质的集合定义为化学物质组（Chemome），化学物质组学方法则可以研究化学物质组的组成及其变化与生物响应（效应）的相互关系。中药复杂体系的表征推动了中药指纹图谱技术的发展。在化学物质组学应用于中药复方研究与开发中，我们提出了层次化的研究策略，即整体化学物质组（药材配伍的传统中药）、有效化学物质组（开发有效组分配伍的组分中药）、有效成分群（未来可以开发有效成分配伍的复方药物）逐步递进，在优先保证疗效的基础上使中药的物质基础和质量控制水平不断提高，并提出了“自上而下”和“自下而上”两种研究模式。英国Brunel大学生物工程研究所所长IanA.Sutherland教授在JournalofChromatographyA上发表的专题综述中评价作者所创建的化学物质组学方法（Chemomics）为“东西方文化有趣的结合”的一个代表，并认为作为一种新的“组学”方法将可能开发出现代复方药物（MCM）。将中药化学物质组学与系统生物学研究相结合，提出了中医药整体系统生物学，即“系统-系统”的研究体系，采用化学物质组学表征中药复杂系统，采用基因组学、蛋白质组学、代谢组学及经典药理学等表征生命系统，建立了研究两个复杂系统相互作用和网络调控机制的方法体系。在此基础上，为适应中医药临床研究和转化医学的需要，我们提出了以构建多层面生物标志物群为特征的临床系统生物学研究体系。开展以临床疗效为导向的中医药现代化研究是中医药发展的最佳途径。二、中医临床系统的生物特征1.采用系统生物学研究方法，促进中药复方研究的发展王永炎院士曾提到：“中医治疗不是单用对抗疗法。而是以中药方剂为主，采用整体综合调节的形式，针对疾病的主要发病环节，通过多途径、多环节作用于人体的多层面、多靶点，使其整体水平、器官水平、细胞亚细胞水平、分子水平得到相应的调整”。中医药的整体观还表现在“医药一体观”，中药方剂源于临床，应用于临床，理、法、方、药通过“辨证-立法-处方”3个环节环环相扣，相互呼应，结合为统一的整体。这些“系统论”与“整体论”思想是中医药理论科学内涵的精髓，与现代生命科学发展主流不谋而合。随着人类疾病谱的转变，西方医学单靶点对抗性治疗难以解决复杂的疾病问题，从人体器官到细胞再到基因的“还原论”模式的缺陷日益凸显，用系统的思维，组合多种学科研究生物学问题的思路已成为生命科学研究的前沿。“系统生物学（SystemsBiology）”是由美国科学家LeroyHood于20世纪90年代末提出的学科理念，它认为在生命过程中更重要的是生命各单元之间存在的相互影响和相互关系，将生命体割裂成彼此孤立的单元去考虑是片面的，主张从系统角度去了解生命体，这与中医学对人体生理病理的认识和治疗疾病的方法“异曲同工”。系统生物学的提出为中医药理论与现代医学的融合提供了方法平台。目前，基于各种“组学”技术的系统生物学研究方法逐步发展为中药复方现代研究的支撑技术，广泛用于中医“证候”模型的评价和筛选、中药配伍规律研究、复方药代动力学研究及新药的开发，极大地推动了中药复方研究的发展。但迄今为止，中医药现代化研究工作还存在以下两个明显的局限。2.缺乏对中医“证候”的诊断和评价指标长期以来中医药的探索性研究沿用了西方医学“还原分析”的模式，割裂了“方-证-病”之间的整体系统性。基础研究多停留在动物和细胞模型，仅通过一个或几个反映西医某一“疾病”特征的特异性药理指标或局部功能的改变来评价药物的疗效。缺乏与中医“证候”相适应的动物模型和评价指标，得到的研究成果不能体现方-证对应的本质特征，无法阐明基于辨证论治的方剂疗效机理，与临床实践“脱节”。在临床诊断中，西医对疾病的诊断具有明确生理生化评判标准（包括影像学在内的生理生化指标），对于靶器官等明确部位的器质性病变具有一定的优势，但对于一些多因素复杂性功能性疾病在早期诊断和干预治疗仍存在诸多问题。现代医学诊疗体系尚不适用于以“证”为基础的中医施治、立法、处方。证反映了患者整体症状体征，包括病理变化和生理变化，但基于中医证候的诊断体系主观性较强，评价指标难以量化，缺乏反映证候学特征的客观化数据。开展“方-证-病”关联的中医药临床系统生物学研究可望为中医药整体观指导下的辨证施治提供基础和支撑。3.从生物学的角度，存在“以药物为本”的干预模式，缺乏对药物系统中的“三各种“组学”技术及在此基础上发展起来的网络药理学、系统生物学等现代生物技术为从整体上研究中药复方的物质基础和作用机制提供了新的思路和方法，也取得了可喜的成绩。然而目前系统生物学在中医药研究中大部分还局限于使用一种或两种组学手段（基因组学、蛋白质组学、代谢组学等），从特定靶点和通路着手探讨机体对中药干预的应答反应，这种方法容易导致对疾病的治疗出现“碎片化”倾向，缺乏系统性和整体性。此外，西方系统生物学把生物体作为和基因、蛋白质、代谢物等相关的整个系统，而把药物作为单一扰动因素，注重单一药物分子干预前后生物系统的整体刻画（网络药理学）即“点（单一药物分子）-系统（生物系统）”的模式，缺乏对药物系统（中药复方）的研究。而中药复方整体性作用的特点本质上体现为中药与人体两个复杂系统间的相互作用并形成一个更高级的系统整体，即“系统（药物系统）-系统（生物系统）”。照搬西方系统生物学模式显然无法与“方-证-病”结合的整体化研究相适应，难以揭示两个系统（生物应答系统和中药复方的复杂物质系统）之间的内在关联，不能从根本上阐明中医药理论的科学内涵。4.中医药临床研究模式的提出和发展纵观近20年来中医药现代化进程，我们需要有两方面的队伍。一方面需要有一支按传统中医药体系，以继承和传承为责任，发扬光大传统中医药理论的队伍；另一方面需要有一支能在中医药理论指导下，结合现代科学技术的发展，以创新为使命的队伍。继承和创新均应以创新为重，继承为创新所用。创新应包括两个方面，一是创新内容从继承中来，但不应受其束缚，而是知识挖掘（KnowledgeMining）；二是传统的中医药理论与现代科学体系和技术的结合、整合和融合，上升为创新的高度。近年来西方医学提出的转化医学B2B2B的双向运作模式，适合于西方医学把大量已取得的基础研究成果（Bench）应用到临床（Bedside）中去，所以B2B2B的模式是BenchtoBedside&BedsidetoBench。而中医药来源于临床实践，它的转化医学模式虽然还是B2B2B，但其表现形式更适宜的是从临床到实验室再到临床（BedsidetoBench&BenchtoBedside）的模式。我们在中医药整体观、系统论的理念指导下，提出了将西医药研究模式（单分子药物针对单个靶点，PointtoPoint,P2P），到单分子药物针对生物系统（PointtoSystem,P2S），进一步发展为药物复杂系统针对生物复杂系统（SystemtoSystem,S2S）的“系统-系统”研究模式。在用化学物质组学表征中药复方基础上，将整合化学物质组学的整体系统生物学结合临床研究，进一步发展为以整合生物标志物体系（IntegratedBiomarkerSystem）为特征，“系统-系统”研究模式的中医药临床系统生物学。无论对于药物复杂系统或生物复杂系统（特别是人的疾病）均要考虑复杂系统的表征方式。对于复杂系统的表征，我们提出要有3个整合：(1）整体表征与局部特征的整合。对生物体系的研究，既要体现整体效应和系统、网络的构建，也要重视靶点和特定信号通路的研究。对中药方剂体系的研究，既要体现方剂整体组成轮廓，也要关注关键成分的量效关系。(2）定性分析与定量测定的整合。对方剂临床效应的评价，传统中医擅长定性描述，须进一步加强定量药效学的研究，将定性分析和定量评价更好结合。对方剂化学表征既要有指纹图谱的定性、半定量评价，也要整合指标成分的定量测定。要将基因组、蛋白组、代谢物组指纹图谱和关键基因、蛋白质、代谢物的定量测定加以整合并聚焦。(3）多层面指标体系的整合和聚焦。要将中医证候指标、临床生化指标及影像学指标和系统生物学指标体系(基因、蛋白质和代谢物3个层次)等多个层面数据加以整合,再用生物信息学方法处理,聚焦得出适宜的整合生物标志物体系(IntergratedBiomakerSystem,IBS)。目前临床很多疾病的诊断依赖病理诊断，不能用作常规诊断或早期预警。多系统复杂疾病缺乏早期、特异性生物标志物。临床治疗缺乏个体化诊疗指标体系和方案。我们提出整合生物标志物体系（IBS）来开展临床系统生物学的“系统—系统”模式研究（见图1）。5.基于临床系统的中药复方生物组，实现信息融合，信息传播。在中国我国，我国可以成功利用我国《监在中医整体观指导下，我们提出发展基于“方病对应、证病结合、方证病整合”策略的“系统-系统”的中医药临床系统生物学研究模式，即在现有系统生物学基础上，发展整合化学物质组学的整体系统生物学，通过化学物质组学表征药物干预系统（中药复方）的组成及相互关系。通过临床系统生物学来刻画生物系统（临床病人）的应答过程，进一步整合分析两个系统间的交互关系，系统揭示中药复方（化学物质组）的变化与生物系统应答的时空响应的相关性，实现“方-证-病”信息的关联。2012年6月国际著名Wiley出版社出版了自开展中医药现代化研究以来第一本英文研究专著《SystemsBiologyforTraditionChineseMedicine》，对这一研究模式进行了全面介绍。中医药临床系统生物学既符合中医药自身特点，又充分整合最新现代科学技术的研究模式、策略和方法平台，应用现代科学语言阐释中医药理论的科学内涵，通过科学数据证实中医药的临床疗效，可望为中医药现代化并走向国际架起桥梁。三、对中医药临床系统生物学的应用中医药临床系统生物学是为适应中医药临床研究和转化医学的需要，以推动4P医学（预测医学、预防医学、个体化医学、参与式医学）为目标，在中医药整体观和系统论指导下，整合运用多种系统生物学技术，通过对病证诊疗方法和药物临床合理应用方法的创新研究来为临床服务，提高临床诊治水平的学科。现阶段中医药临床系统生物学的主要研究目标是要针对中医药研究中存在的“方、证、病割裂，基因、蛋白质、代谢物分离”的通病，建立一套整合的生物标志物体系（IBS），包括中医证候生物标志物群、临床生化指标及影像学标志物、系统生物学标志物群多个层面，系统生物学指标又可以包含基因、蛋白质、代谢物多个层次的标志物群。应用于疾病早期预警、临床诊治、指导个性化用药、疾病预后以及药物评价。1.中医药传统诊疗方法的不足当前国际主流医学界也已普遍认识到过去单纯对治疗疾病的关注具有局限性，而应该是对人体健康的全面关注，“健康医学”、“预防医学”等提法基本上都体现了这一理念。实际上中医药一贯强调“治未病”，说明我国很早以来就高度重视对疾病的早期诊治，甚至包括对亚健康状态的关注和早期预警，然而中医药的诊疗方法和指标在客观化和标准化方面还有待发展。将中医药“治未病”的学术思想与临床系统生物学研究结合起来，通过对健康对照、亚健康状态、疾病早期的比较研究，有望发现与亚健康状态相关或预测疾病发生风险的系列标志物，可用于早期预警，以便更早做好防范，降低疾病的发生风险，而疾病早期发现的生物标志物也有助于提高疾病的早期诊断率，尽早治疗，提高治愈率或延缓疾病的进展。2.整合系统生物学体系疾病谱的变化使得多因素复杂性疾病，如心脑血管疾病、代谢综合征、恶性肿瘤等成为人类健康的主要威胁。常规西医诊断的目的是治疗人的病，针对的是靶器官、靶组织和靶点，注重疾病的病理变化，在病理变化局部特征的描述上有优势。西方医学应用现代仪器设备以及影像检查手段进行生化指标检查，运用量化的指标进行诊断，因此对于病因明确、靶点单一的疾病具有显著优势，但对于一些未产生实质病变或多因素复杂性疾病在早期预诊和判断预后均存在较大缺陷，容易犯盲人摸象的错误。而常规中医诊疗的目的是治疗生病的人（证候），针对的是改善患者整体的症状体征，不仅注重于患者病理的变化，同时也关注生理的变化。但是中医诊断对于疾病是一种语言的描述，指标的量化和标准化还有待加强。因此，我们提出通过临床系统生物学研究建立一套整合的生物标志物体系，包括中医证候生物标志物群、临床生化指标及影像学标志物、系统生物学标志物群多个层面，通过与各种临床表型的相关性研究，可望更全面更准确的应用于多因素复杂性疾病的诊断分型。药物干预会对代谢酶的表达、代谢产物的组成和相对浓度等产生重要的影响，采用整合系统生物学体系可在药物干预的早期甚至在药物干预之前预测药物反应（药效或毒性）。通过多种生物样本（体液、组织和细胞等）的采集整合，多种检测、分析技术的整合运用，多种数据处理方法的整合分析，阐述基因变异、蛋白表达和代谢扰动之间的内在联系，找出药物治疗相关的生物代谢标志物，开展药物治疗的安全性和有效性评价。3.药物药效学和药动学行为的差异相同剂量的药物可能会引起药物反应（疗效和毒性）的个体差异，引起此种差异的主要原因为基因的多态性及其可能导致的体内过程（吸收、分布、代谢、排泄）不一致性。遗传多态性通过影响编码蛋白质的活性，进而引起药物药效学和药动学行为的差异，以药物转运、药物代谢和药效学的差异为表现形式。通过药物基因组学分析基因存在的单核苷酸多态性（SNP），或者药物代谢组学揭示代谢系统的个体化差异，结合临床相关数据，一方面预测药物的效应和毒性反应来达到个体化治疗目的，另一方面发现群体规律提示新的药物作用靶点。通过药物个体化用药基因和代谢标志物检测，为临床个体化治疗提供数据支持，从而提高药物治疗有效率，降低毒副作用和医疗成本。同时开展研究遗传因素与临床合理用药之间的重要关系，确定引起个体对药物处置和疗效差异的遗传学特征，为临床合理用药和新药研发与评价提供强有力的科学依据。4.治疗药物监测药物干预人体过程中，通过阐述药物体内过程，研究药物与人体相互作用规律，促进医药结合，指导临床合理用药，提高临床治疗水平。例如治疗药物监测（TDM）、药物代谢动力学（药动学）研究以及药物相互作用规律研究等。在总结进行监测的治疗药物及其给药剂量、疗效、不良反应以及个体之间的相互关系的基础上，建立治疗药物监测网络和监测药物的数据库，发现并探索监测药物群体特征，为临床服务；开展药物的药动学研究及制剂生物等效性评价，提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据，为设计和优化临床研究给药方案提供有关参考信息；采用体外（肝微粒、原代肝细胞、Caco-2细胞）和体内（动物）模型等方法，研究药物对药物代谢酶（CYP450）和转运蛋白（P-gp）的诱导或抑制作用，以及诱导或表达下调作用，探讨中药之间或中药与西药产生相互作用的关系，优化药物治疗方案，保障药物治疗的有效性和安全性。四、cdkal1、igf2bp2、mthfr基因与糖尿病肾病相关联的临床样品分析以近年来我们开展的糖尿病肾病（DN）中医药临床系统生物学研究为例。糖尿病肾病为糖尿病引起的肾脏损害，其特异性表现为糖尿病性肾小球硬化症，其基本病理病变为肾小球基底膜增厚和系膜基质增生，临床主要表现为蛋白尿、水肿、高血压及肾功能损害，因此糖尿病肾病的早期诊断极为重要。西医诊断强调患者的肾功能，以蛋白尿作为诊断的金指标，但是对于未出现明显蛋白尿的糖尿病肾病患者就难以诊断；中医诊断强调患者证候，包括气虚、阴虚以及阳虚证，但是目前缺乏可以量化的指标。临床合作单位北京中日友好医院等开展了多中心、随机、双盲、安慰剂对照临床试验，证实了中药糖肾方干预气阴两虚夹瘀型2型糖尿病肾病在降低蛋白尿、改善肾功能等方面具有确切临床疗效。我们首先开展了基于横断面分析的临床系统生物学的研究，分别建立了血浆样本代谢指纹谱分析、七大类百余种磷脂定性与定量分析、15种脂肪酸定量分析、21种嘌呤嘧啶相关代谢物定量分析和8种硫醇氨基酸定量分析，以及14种糖尿病肾病相关基因PCR定量的方法学平台。通过整合代谢物定量测定与代谢指纹谱、代谢组学研究与临床生化数据、代谢组学与基因组学研究的结果，建立了包括西医病理生化指标、临床系统生物学所确定的生物标志物（基因、蛋白质、代谢物等）和中医证候量化指标（整体的症状体征）3个方面，应用于糖尿病肾病气阴两虚证诊断（辨证）和疗效评价（论治）的整合指标体系。通过应用于糖尿病肾病气阴两虚证（细分为偏阴虚组和偏气虚组）及阴阳两虚证病例150例的预测诊断，使用建立的整合指标体系中医分型预测总准确率达到100%，而仅使用中医症状指标预测总准确率为77.8%，具有明显的临床应用优势。对定量代谢组学筛选得到的标志物与中医症状进行相关性分析，糖尿病肾病中脾胃气虚、瘀血症状与磷脂代谢中的PE750、PG747显著负相关；嘌呤嘧啶代谢中，肌酐与气血虚、瘀血症状显著正相关，胞苷与瘀血症状显著正相关，肌苷与肝肾阴虚症状显著负相关，胸苷、腺苷、肌氨酸与痰湿症状显著正相关，此外，腺苷还与气血虚症状显著正相关；硫醇氨基酸代谢中，Cys-gly与阴虚内热症状，SAH与瘀血症状，SAM与气血虚症状，Hcy与脾胃气虚、痰湿症状及症状总分均显著正相关。这表明主观的中医分型症状得分与客观的代谢标志物含量相关，可实现客观量化。基因研究包括4个糖尿病易感基因：CDKN2A,CDKN2B,IGF2BP2和CDKAL1;4个糖代谢基因：醛糖还原酶（AR），糖基化终末产物受体（AGER），受体葡萄糖转运蛋白1(GLUT1）和胰岛素样生长因子2(IGF2）;4个血流动力学相关基因：血管紧张素原（AGT），β3-肾上腺素受体（ADRB3），血管紧张素Ⅱ受体-2(AGTR2）和血管紧张素转换酶（ACE）基因和基础代谢有关的重要基因蛋白激酶C(PRKCA）和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因（MTHFR）。结果表明，在糖尿病肾病病理及证候进化发展的各个阶段，CDKAL1、IGF2BP2、AR、AGT及MTHFR基因表达在不同分组间具有显著差异，可作为糖尿病肾病发展的潜在基因标志物，其联合应用可以作为中西医诊断的辅助检测指标，提高诊断的准确率。特别是PRKCA基因对于气阴两虚偏气虚的分型非常敏感，表达量显著增高（P<0.001）。PRKCA作为蛋白激酶C，能激活细胞质中的多种酶并参与多种生化反应的调控。而“气”在中医上也偏重于转运和代谢，是体内的一种推动各个组织器官正常运转的能量，与PRKCA的功能有所交叉，这可能是导致PRKCA对气虚较为敏感的原因。CDKAL1与MTHFR基因对于气阴两虚偏气虚也显示出高度的特异性。我们实现了4个整合：代谢指纹谱与定量代谢循环的整合，代谢组学与临床生化指标间整合，中医症状与代谢组学及临床生化指标间的整合，代谢与基因通路的整合。在此基础上，聚焦得到一个潜在的生物标志物群，包括4个代谢物和4个