高等药物化学

DNAMethyltransferases（DNMTs）小组成员：户彪阮霞赵丽杰王帅2014.11.7主要内容研究背景DNMTs分类及其结构DNMTs的功能DNMTs抑制剂的相关研究●●●●表观遗传学是研究基因的DNA序列不发生变化的前提下，通过核苷酸或染色体的可逆性修饰使基因表达可遗传的变化的遗传学分支学科。●●●研究背景近年来表观遗传学成为生物学、医学等领域内的研究热点，越来越多的研究证明，很多疾病的发生与表观遗传修饰的异常相关，如哮喘、肝癌、和HMT（histonemethyltransferase）异常引起的多种肿瘤等。因此。人们越来越认识到表观遗传学的相关研究在人类许多疾病的防治过程中具有的重要意义。表观遗传学的调控机制主要包括DNA甲基化（DNAmethylation）、组蛋白修饰（histonemodification）、非编码RNA（noncodingRNA，ncRNA）作用等。DNA甲基化与肿瘤的关系肿瘤发生是一个多步骤、多阶段的复杂过程,包括原癌基因激活和抑癌基因失活。

近来,人们发现肿瘤细胞的总体甲基化水平比正常细胞低,但是伴有某些CpG岛甲基化程度增高。位于正常细胞表达基因启动子附近的CpG岛通常处于非甲基化状态；而在肿瘤细胞中,这些CpG岛变为甲基化状态,其相关抑制基因的表达亦被关闭。抑癌基因的启动子区甲基化水平偏高，所以研究DNA甲基化转移酶抑制剂，以期能够产生抗癌效果。DNA甲基化是第一个被确认的表观遗传学修饰，参与调控基因表达和细胞分化的过程。DNA的存在不是孤立的，而是和组蛋白及其它染色体相关蛋白形成一个复合体。在真核细胞中，DNA以染色体的形式存在，核小体是染色体的基本组成单位，由146bpDNA缠绕在以组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个分子为中心的八聚体上组成，每个核心组蛋白由一个折叠区和一个氨基末端结构域形成，其显著特征是其氨基末端伸向外围，易于被甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共价修饰。另一类蛋白，组蛋白H1，可与线形DNA结合以帮助后者形成高级结构与核小体相连。

一、DNA甲基化DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在CpG二核苷酸的胞嘧啶分子的5'碳原子上添加一个甲基基团的化学修饰。DNA的甲基化修饰主要发生在CpG岛（CpGislands,CpGIs），即跨越至少200个碱基对，GC含量超过50%的DNA片段，主要位于基因的启动子和第一外显子区域

。○○首先DNA甲基化转移酶与DNA结合,将目标核苷酸反转暴露于DNA双螺旋之外,并嵌入酶的袋形催化结构域里。与此同时,碱基对氢键断裂,邻近碱基间堆积作用缺失。DNA-C5甲基转移酶的活性位点(motifIV)中的保守序列PCQ中的半胱氨酸残基中的硫醇基对底物C6位碳进行亲核作用,并形成共价键激活。由于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基团结合于S原子上,分子极不稳定,在酶的作用下甲基从SAM转移至被激活的C5,随着C5位上质子的释放与共价中间物的转变,最终完成DNA的甲基化修饰过程。●原理二、DNMTs1948年Hotchkiss在牛胸腺内观察到甲基转移酶催化的DNA甲基化;1964年,Gold和Hurwitz等在Escherichiacoli中鉴定出第一个DNA甲基转移酶。●分类DNA甲基化转移酶（DNMTs）催化和维持DNA的甲基化。根据催化反应类型⑴将腺嘌呤转化成N6-甲基腺嘌呤;

（原核生物）⑵将胞嘧啶转化成N4-甲基胞嘧啶;

（原核生物）⑶将胞嘧啶转化成C5-甲基胞嘧啶。（原核生物；真核生物）DNMTsDNMT3aDNMT3LDNMT3b催化DNA复制过程中的半甲基化CpGs维持甲基化从头甲基化催化胚胎发育期甲基化DNMT1调节蛋白DNMT2tRNA甲基转移酶微弱的DNA甲基化酶活性（哺乳动物）维持性甲基化酶DNMT1，可在甲基化的DNA模板链指导下在对应部位发生甲基化；二是从头甲基化酶DNMT3，它必需甲基化的DNA模版，可以使完全非甲基化的DNA完全甲基化修饰。DNMT1(维持甲基化)DNMT3(从头甲基化)DNMTs的甲基化作用几乎所有的甲基化胞嘧啶残基都出现在对称序列的5'—GC--3'二核苷酸上1、DNMT1DNMT1是1988年Bestor等从真核生物克隆出来的第一个DNA甲基转移酶。DNMT1结构183kDaN-末端大结构域C-末端则为催化结构域(CatD),1124~1620aa处⑴带电结构域(结合DMP1转录抑制蛋白)⑵核定位信号(NLS)⑶PCNA结合位点⑷复制叉作用位点⑸锌离子结合域CXXC(ZnD)⑹polybromo结构域motifⅠ、Ⅹ折叠一起形成SAM结合位点motifIV中的PRO-CYS二肽,提供活性位点中的甲醇基包含众多调控位点,参与细胞内定位及催化活性的调节包含6个甲基转移酶高度保守位点,motifⅠ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ等ZnD优先识别甲基化CpG,ZnD与甲基化DNA结合可以引发DNMT1催化中心的异构激活,从而引起甲基化蔓延。CatD优先作用于半甲基化底物DNMT1还存在3个不同的剪接异构体:DNMT1s,DNMT1o和DNMT1p。DNMT1s表达于体细胞中,DNMT1p只发现于粗线期精母细胞,DNMT1o特异性表达于卵母细胞和着床前胚胎中。●●●DNMT1的主要作用是在DNA的复制和修复中维持其甲基化，特异性的作用于半甲基化的CpGs二核苷酸。DNA复制后，DNMT1可识别半甲基化的CpGs并依照模板链的甲基化模式合成新的甲基化DNA。通过这个过程，DNA的甲基化修饰得以遗传下来。DNMT1p不具有DNMT1活性,因为它的第一外显子ORF太短,可能干扰了正常翻译。DNMT1oN-末端缺少118个氨基酸,但是获得了更高的稳定性,在卵细胞胞浆能够长期存在。当胚胎发育至8细胞阶段时,DNMT1o从胞浆转移至核内,并在第四次S期复制中维持印记基因的甲基化。DNMT1s是复制后维持甲基化的关键酶,沿DNA高速进行性甲基化,CGCTC位点趋向终止此过程,它可能是DNMT1作用的终止子,但同时也是阻遏转录因子CTCF的结合位点,通过募集CTCF或独立途径能够阻止DNA甲基化作用向DNA非甲基化区域蔓延扩展。DNMT1构象上的变化与活性状态转变有关,能影响近端氨基酸和催化结构域的结合,还可能引起Ser515的磷酸化。●●●DNMT3a和DNMT3b拥有类似的结构:2、DNMT3(1998年)●●半胱氨酸富集的Zn结合位点(含有多个Cys、6个CXXC结构)高度可变的N-末端具有催化功能的C末端由于DNMT3a、DNMT3b的DNA结合位点均较小,大约50个残基左右,因此,DNMT3常以二聚体形式存在以增大和底物的接触面,在一次作用过程中可以同时甲基化两个CpG位点。PWWP(Prolinetryptophantryptophanproline)结构域,其可能与DNA非特异性结合有关;DNMT3a和DNMT3b的功能主要是针对未甲基化的CpGs开始重新甲基化（denovomethylation），对CpG位点的侧翼序列有一定的倾向性。5′-CTTACpGCAAG-3′优先被识别,而对5′-TGTTCpGGTGG-3′几乎没有活性。重新甲基化的过程主要发生在胚胎干细胞和癌症细胞。DNMT3a对富含CpG的片段甲基化效率不高,但是其作用更准确。区别：DNMT3b能够甲基化着丝粒远端的重复序列,其间具有高密度的CpG位点,它是以进行性方式行使甲基化功能的,这种方式有利于短时间的甲基化。在DNMT3a和DNMT3b缺乏的胚胎干细胞中,DNMT3L散在分布于核和胞浆内。分布在结构上,DNMT3a与DNMT3L形成一个四聚体,DNMT3a二聚体位于中间位置,DNMT3L二聚体位于外侧,两者通过C-端相接触。通过C-端的G718-L719-Y720结构,DNMT3L能够稳定DNMT3a活性位点的构象,包括亲核基团Cys706。DNMT3a-DNMT3L的结合提供了一个稳定而广泛的极性作用,增强了DNMT3a与SAM的结合。DNMT3a和DNMT3b

存在时，DNMT3L作为DNA从头甲基化调节因子可以通过与DNMT3a和DNMT3b的C端结合而转移入细胞核内,可提高它们的催化活性,正向调节DNA从头甲基化。作用：DNMT3L是一种DNMT3类似蛋白,具有半胱氨酸富集的锌结合区域,缺少C端的酶催化活性域,所以没有单独的催化活性。DNMT2存在于胞浆和核内,细胞内定位显示大量的DNMT2结合于核基质处,在有丝分裂前期进入细胞核内,呈现类纺锤体式定位,并在细胞分裂过程中可观察到与DNA结合。3、DNMT2(1998年)结构研究表明：DNMT2序列与原核生物DNA甲基转移酶高度同源；缺乏N-末端活性结构域,包括391个氨基酸,大小约为40kDa,含有10个高度保守DNA甲基转移酶基因序列；在motifⅧ-Ⅸ区有41个保守的氨基酸,其中包Cys-Phe-Thr三肽和Asp-Ile二肽,这个区域与原核生物DNA甲基转移酶的TRD结构域相一致。在组织内,DNMT2表达广泛,主要存在于肌肉、发育中的胚胎内脏、卵巢囊肿以及增殖中的睾丸细胞。DNMT2的功能性底物为RNA分子,tRNAAsp是其主要靶标,它能够特异性甲基化tRNAAsp反密码子环38C，这个功能具有高度的保守性。人们对DNMT2功能的认识一直存在争议。目前研究认为它的DNA甲基化酶活性可能非常弱,而且识别位点并非CpG,因而在体外酶活性实验中,常常难以观测到DNA甲基化酶活性。在果蝇胚胎中的研究证实,DNMT2的作用位点主要是CpT和CpA,其过表达将导致基因组显著高甲基化。DNMT2的C79A、E119A、R160A和R162A位点是DNMT2催化活性所必需的,而它们与其他DNMTs相应位点具有高度的一致性，所以，认为DNMT2和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的催化机制极其类似。3、DNMTs家族成员及其结构三、DNMTs的功能1、DNMTs与基因表达一般认为DNA甲基化通过两种途径抑制基因表达:直接阻碍转录因子与甲基化的CpG岛结合,直接抑制基因表达；通过招募DNA甲基结合蛋白(Methyl-CpG-bindingproteins,MBP)及一些阻碍复合物,阻止转录因子与特定DNA序列结合,间接抑制基因表达。●●DNMT的基因表达抑制作用与组蛋白修饰和染色质重塑相关DNMTs与组蛋白修饰相关因子的相互作用是DNMT调控基因表达的重要手段。DNMT1的N端可与HDAC1、HDAC2结合，DNMT3a、DNMT3b也可招募HDAC，从而使组蛋白去乙酰化；DNMTs还与组蛋白甲基化相关。DNMT1的N端可以招募组蛋白甲基化酶Suv39h1(Suppressorofvariegation3-9homolog1)和识别HP1(Heterochromatinprotein1)；Dnmt3a也可与能识别甲基化组蛋白的HP1和能直接识别对称甲基化组蛋的H4R3me2s(SymmetricmethylationofhistoneH4arginine3)相互作用。DNMT1的N端可以识别DNA甲基结合蛋白MBP家族中的MBD1(Methyl-CpGbindingdomain1)、MBD3、MeCP2(Methyl-CpGbindingprotein2)，DNMT通过招募这些蛋白,与组蛋白修饰和染色体重塑共同作用,间接抑制基因表达。DNMT间接的基因沉默作用还表现在与一些共抑制子的相互作用上。如DNMT3a可以与一种转录抑制蛋白RP58结合,二者共同抑制基因表达。抑制基因表达DNMT3b在HeLa细胞中可以与共抑制子SIN3A(Kinetochoreassociatedprotein)相互作用,同时也可与驱动蛋白KIF4A(Kinesinfamilymember4A)和凝缩蛋白（condensin）相互作用参与染色质浓缩。DNMT与相关蛋白的相互作用也是DNMT参与组蛋白修饰、染色体变构的途径一些研究表明DNMT与基因沉默相关因子PcG（Polycombgroup）可相互作用。主要通过PcG蛋白组成的多聚复合物PRC（Polycombrepressivecomplexes）2和3中的EZH2与DNMT相互作用，共同抑制基因的表达。最近的一项研究中,小鼠LSD1的编码基因Aof2被敲除后DNA甲基化水平下降,DNMT1水平下降。组蛋白甲基化酶SET7也可调控DNMT1的稳定性，SET7通过直接与DNMT1相互作用,并特异地甲基化DNMT1的第142位赖氨酸,实现其对DNMT1数量和活性的抑制作用。因此，这些因子可以通过调控DNMT的数量和活性间接参与基因沉默,同时DNMT也通过这些因子参与其他水平的基因表达调控作用。●●DNMTs将基因启动子区的DNA甲基化也是抑制基因表达最常见的表观遗传现象之一。启动子区发生甲基化后，甲基基团本身以及甲基化DNA募集的甲基化结合蛋白，如MeCP2，所造成的空间位阻能够抑制转录因子的结合。此外，MeCP2可以募集组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的结合，使甲基化DNA附近的组蛋白发生去乙酰化，形成较为紧密的染色质构象从而抑制转录。原理：2、DNMTs与基因印记基因印记是指来自父方和母方的等位基因在通过精子和卵子传递给子代时发生了某种修饰,这种作用使其后代仅表达父源或母源等位基因的一种。迄今,在哺乳动物中已经发现的印记基因大约有70多种,其表达控制着胚胎的发生、发育过程。与胚胎发育相关的DNMTs主要包括3种:DNMT1o、DNMT3a2、DNMT3L。在发育早期,DNMT1o是维持印记基因甲基化形式的主要酶之一。它在卵细胞1、4细胞阶段存在于胞浆中,8细胞阶段则转移入核内。胚泡植入后,DNMT1o则被DNMT1s取代。DNMT3L缺乏酶活性,然而却是卵细胞从头甲基化所必需的,DNMT3L缺乏引起不孕。●●3、DNMTs与基因组不稳定性基因组不稳定包括DNA序列改变,非整倍体性,染色体易位,基因拷贝数增加等。DNMTs可能从以下几个方面影响基因组稳定性：(1)影响端粒的完整性可能与DNMTs对非CpG位点的甲基化有关。而在DNMTs缺陷的胚胎干细胞中,这种甲基化修饰明显减少,导致端粒重组增多,主要表现为姐妹染色体交换增多和端粒长度不一(2)影响转座元件的活性当环境或其他因素导致DNMTs活性降低时,基因组出现低甲基化状态,甲基化不足引起众多转座元件的激活,从而出现基因组不稳定(3)影响DNA错配修复系统(MMR)的效率DNMT1的丧失可能阻碍DNA复制相关的MMR进程,从而导致MMR效率的下降4、DNMTs与染色质修饰体系组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是组蛋白修饰体系中的一个重要成份,转录抑制复合物DNMTs/HDAC或MBP/HDAC参与沉默各种组织特异性基因和印记基因。参与polycomb蛋白(PcG)作用过程通过DNMTs保守的PHD结构,DNMT3a、DNMT1均能与H3K9甲基转移酶SUV39H1以及SUV39H1结合伴侣HP1β结合,影响它们甲基化H3K9的活性,并对H3K4甲基化也可能产生影响。此外,DNMT1能与hSNF2H染色质重塑酶结合,高亲和力结合DNA底物。⑴⑵⑶5、DNMTs与疾病DNMTs异常可能通过3种方式改变DNA甲基化模式而导致疾病:正常情况下高甲基化的CpG岛出现低甲基化或未甲基化的CpG岛出现高甲基化,从而引起某些基因不正确地激活或沉默；印记基因失调影响机体生长发育,与一些先天性疾病有关；DNMTs功能缺陷引起基因组不稳定。⑴⑵⑶DNMTs与DNA高甲基化现在认为，肿瘤细胞具有以下特征:

逃避细胞死亡(resistingcelldeath)对生长抑制信号不敏感(evadinggrowthsuppressors)诱导新血管生成(inducingangiogenesis)无限的复制潜能(enablingreplicativeimmortality)组织浸润和转移(activatinginvasionandmetastasis)

持续的增殖信号(sustainingproliferativesignaling)能量代谢的改变(reprogrammingofenergymetabolism)逃避免疫系统的破坏(evadingimmunedestruction)近年来的研究发现，特定基因的DNA高甲基化在这些过程中均发挥重要作用。逃避细胞死亡通常情况下，细胞在接触抑制辐射凋亡信号分子等刺激时会发生凋亡，但是癌细胞却可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖。p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细胞发生凋亡，50%的癌症中存在p53基因的突变失活。p53基因编码区的甲基化状态容易因为脱氨基作用发生5mC-T的转换。同时，INK4a/ARF抑癌基因启动子区域的甲基化可以使p14ARF表达下降，导致原来受p14ARF抑制的MDM2表达上升，MDM2进而结合p53并使后者发生蛋白质水平的降解，使细胞逃避p53引起的凋亡。BCL-2相关蛋白BNIP3，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体，可以诱导细胞在缺氧情况下发生凋亡。BNIP3启动子区域包含CpG岛，细胞恶变时BNIP3启动子区高甲基化引起BNIP3表达沉默，导致细胞逃避缺氧时的凋亡。●●举例：对生长抑制信号不敏感细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机制，其中由pRb参与的G1/S检测点调控尤其重要。未磷酸化的pRb与E2F结合，阻止细胞从G1期进入S期。正常情况下p16蛋白与CDK4/6结合，阻止CDK复合物与周期蛋白D结合，使pRb不能磷酸化。p16基因的启动子区域甲基化后，其表达被抑制，使得p16蛋白依赖的TGF-β生长抑制信号通路失去作用。调控机制：新血管的生成是癌症发生中重要的步骤。诱导新血管生成血小管反应蛋白1(thrombospondin-1，TSP1)是另一个抑制血管生成的蛋白，TSP1基因启动子区域甲基化引起基因表达抑制，进而导致肿瘤发生过程中细胞外基质重构和血管生成。新血管生成首先需要金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)分解细胞外基质，再通过血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)来诱导血管生成。组织金属蛋白酶抑制剂3(met