脐血分血及CIK细胞培养流程

1、脐血分血及CIK细胞培养流程采集新鲜的自体外周血入血液采集袋（含28mL枸橼酸纳抗凝剂），将血液采集登记表标记细胞编号，用铅笔在采集袋表面空白处也标记细胞编号。检查全血有无凝血，凝血会导致单核细胞得率降低，细胞采集到接收时间段是否在六小时之内，超过六小时细胞得率降低。热合机在血液采集袋输入管1/3处热和一个封口，用酒精喷血液采集袋表面，将血液采集袋放入传递窗。准备好50mL离心管、3mL抗凝管、生理盐水、10mL移液管、T-75瓶、T-25瓶、淋巴细胞分离液、废液缸。采集袋拿进超净台之前再喷酒精。拧扭输出管，使血液回流入采血袋，用止血钳夹住采血袋输出管，用酒精棉球擦拭输出管管表面，剪刀剪去封口

2、，剪成斜口（方便倒出），准备好两个50mL离心管，输出管口火焰灭菌后，用止血钳控制管口将全血倒入50mL离心管，最后采血袋留3mL全血倒入抗凝管中，抗凝管血混匀后计数（中间细胞Mid+淋巴细胞L），用作第三方检测（乙肝HBsAg、丙肝HCV-IgG、梅毒TRUST、艾滋Anti-HIV、谷丙转氨酶ALT、血型Rh(D)、梅毒螺旋体特异性抗体TPPA），此时记下全血体积，将采血袋标记细胞编号保存于-20保留血样，以防日后需要检测。，并记下采血袋批号用于填写细胞档案。准备好数个50mL离心管，分别加入20mL淋巴细胞分离液，将全血缓慢加入勿破坏淋巴细胞分离液液面层。淋巴细胞表面。一定配平后离心，2

3、000rpm，离心20min。取出离心管，弃掉最上层的血浆层。准备两个干净的50mL离心管，旋转吸取单核细胞层（白膜层）加入离心管，全部吸完后，记下单核细胞体积。11、准备几个新的50mL离心管，每管分装10mL单核细胞，生理盐水分别加至50mL（与生理盐水1:4），混匀后1800rpm，10min离心，洗涤细胞第一次。12、取出离心管，倒掉上清，取10-15mL生理盐水依次重悬单核细胞，再取10-15mL生理盐水洗涤单核细胞离心管，减少细胞损失，将单核细胞重悬入一个或两个离心管，生理盐水加至40或80mL（细胞浓度太大时加至80mL），细胞计数仪计数（中间细胞Mid+淋巴细胞L）。按照接种密

4、度为2.5-3109个/L计算接种几个T-75瓶。注:中间细胞包括嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞。 密 度 40 或 80 =2.5-3109个/L 40或60或80或100或120或140或160分母为40则接种4个T-75瓶，160则接种16个T-75瓶，每瓶10mL。13、1800rpm，10min离心，洗涤细胞第二次。14、用40或60或80或100或120或140或160mL培养基 = 1 * ROMAN I重悬单核细胞，每瓶10mL接种于T-75瓶中，第0天。15、CIK细胞第一天，T-75瓶，加10mL培养基 = 2 * ROMAN II。第二天，T-75瓶，加30mL培养

5、基 = 3 * ROMAN III。第三天，观察CIK细胞。第四天， 两个T-75瓶CIK细胞装一个细胞培养袋，补加300mL培养基 = 3 * ROMAN III，装袋前显微镜下观察细胞状态，有无污染，培养基染色是否一致，检查第三方检测结果是否正常，正常方可装袋。16、装袋后每隔三天进行细胞计数，补液，补培养基 = 3 * ROMAN III（补液后细胞密度维持在1.5-2109个/L），留样，至细胞第14天成熟。无血清培养基 = 1 * ROMAN I配制：空白培养基1L + 10mL IFN-（终浓度1%）+ 10mL成分 = 1 * ROMAN I（终浓度1%）无血清培养基 = 2 *

6、 ROMAN II配制：空白培养基1L + 20mL IL-1（终浓度2%） + 1支IL-2（终浓度2%）无血清培养基 = 3 * ROMAN III配制：空白培养基1L +1支IL-2（终浓度2%）IL-1原液配制：空白培养基40mL + 1支IL-1IFN-原液配制（瓶上有标记）：因子 = 4 * ROMAN IV配制：1支用10mL培养基溶解，1.5mL分装。因子 = 4 * ROMAN V配制：1支用15mL培养基溶解，1.5mL分装。因子 = 6 * ROMAN VI配制：1支用10mL培养基溶解，1.5mL分装。抗原肽：每支溶于0.5mL培养基，相同病种抗原肽混合后，冻存至-20

7、，使用时1%终浓度。注意事项：1、血液第三方检验合格结果经主管审核无误后，上报OA合格血液单，否则上报OA不合格血液单。2、细胞治疗原则：先采血后回输。回输前患者提前输抗过敏药。提前两天通知患者回输（有一些患者是外地的）。3、每次配液后及时填写配液记录。4、接种前细胞一定要混匀；回输时细胞一定要打匀，防止结块。5、一定记得回输时人血清白蛋白的加入，使细胞包裹上血清白蛋白，不容易结块，细胞结块容易引起血栓。6、两份血同时做时一定要在50mL管体上标细胞编号或者患者姓名，不同血在不同的超净台操作。7、传染病患者分血操作放在最后，一定换手套喷酒精，该患者的培养基一定要分装。8、超净台内操作，严禁双肘

8、放在操作台面上。9、注射器和培养袋接口是污染高发区，严禁触碰。10、瓶盖等放在远离操作容易碰到的地方。11、细胞培养袋补液前，管口有液体的话记得甩一下管口。12、装袋时不留样，以后每次补液都要留样。13、分血及回输时，生理盐水瓶一定要拿对。自体血出细胞前一天记得冰盐水（50mL）吹打DC细胞。14、琼脂平皿上的标记写在琼脂背面，盖子上不写东西。15、补液前，培养基提前拿出来至室温再用。16、臭氧杀菌的原理：臭氧与细菌细胞壁脂多糖、脂蛋白结合，氧化细菌，杀死细菌。17、T-25瓶最多可以加10mL液体，T-75瓶最多可以加50mL液体，T-175瓶最多可以加250mL液体。18、细胞补液后密度控

9、制在1.5-2109个/L，因为这个密度下细胞长得快。19、淋巴细胞分离液：全血=20mL：20-25mL，分离单核细胞没问题。20、掉在地上的没有拆包装的耗材，喷酒精后拿进超净台使用。21、清场：关风机，酒精擦台面及物品，关操作台，开紫外。22、DC细胞加因子后轻轻混匀培养基。23、开盖后的生理盐水要用点着的酒精棉球擦拭，以防金属碎片进入培养基。24、回输当天显微镜检查最后一次补液T-25瓶有无异常，检查当天T-25瓶有无异常。25、补液前查看上一次补液的留样瓶，无污染后再补液。26、细胞回输前72小时不再补液，因为三天内留样瓶必定可以观察到是否污染，以保证回输细胞无污染，质量合格。27、分血前，一定要有病人的细胞治疗申请单，病人体检报告（传染病四项，三个月之内的体检结果）、患者签字。查看患者的血常规有无异常，关于培养天数和注意事项及时与市场代表沟通。28、使用输血器回输（有过滤装置）。29、病人做过放化疗之后一周，白细胞恢复的差不多再进行采血。血常规正常值范围：红细胞RBC：女 4.0-5.0101