第六章 化学物质与蛋白质的相互作用1-2节

第六章

化学物质与蛋白质的相互作用

Interactionsbetweenchemicalsandproteins

主要内容第一节化学物质对蛋白质的沉淀作用

Precipitationofproteinsbychemicals第二节化学物质对蛋白质的稳定作用

Stabilizationofproteinsbychemicals第三节化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用

Covalentmodificationofproteinside-chaingroupsbychemicals第四节蛋白质光谱探针

Spectroscopicprobeofproteins教学要求熟练掌握化学物质对蛋白质的沉淀作用、变性作用和稳定作用；掌握化学物质对蛋白质侧链基团的共价修饰作用；掌握蛋白质吸光光度、荧光等分子光谱探针对蛋白质定量分析。在生物体内，蛋白质（包括酶）占细胞干重的70%以上，种类繁多，在生命活动过程中起着发挥各种各样的作用。随着人们对环境保护和生活质量要求的提高，蛋白质在食品、医药（生化药物、临床检验、药物筛选等）、环保（环境分析）、农业、日用化工（化妆品）、精细化工（酶催化合成）等领域的应用日益广泛。在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。

化学物质与蛋白质的相互作用球状蛋白三级结构的主要特征绝大多数的蛋白质折叠成为近乎球状的结构。球状蛋白质一旦具有三级结构后，蛋白质内部变得更为紧密，内部的空间约有75％被原子所充满。这样的密集程度远远超过在液体中的小分子，可以与一些晶体的情况相比。可以认为蛋白质是带有极性外套的油滴，也就是“非极性在内，极性在外”。大量蛋白质的X射线晶体衍射分析统计的结果充分证明了这一规律。蛋白质内部主要是一些非极性残基的侧链在分子内部约有63％是丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等带电的残基，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和精氨酸只有4％。约95％的带电的侧链是分布在蛋白质的表面；约14％的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸在蛋白质分子表面。在蛋白质的内部也存在极少量的亲水残基，在蛋白质分子的表面也常见到一些疏水的残基。这些“异常”分布的残基，致使肽链的局部结构发生“扭曲”，一些键的张角与一般正常的值有所偏离，蛋白质中这些局部的构象具有相对偏高的能量，相对地处于较不稳定的状态，在外界很小的扰动作用下，就能发生变化。原则上，一些相对规则的

-螺旋和

-折叠分布在球状蛋白的内部，而且压积得很紧密，致使球状蛋白成为致密的结构；那些连接

-螺旋和

-折叠的规整性相对差一些的二级结构，转角和环状以及特定的“无规”卷曲，则更多地是分布在球状蛋白的外周。还值得指出的是，在很多蛋白质分子的内部还存在着数量不同的水分子，这些水分子也和一些极性的基因或负电性的原子形成氢键。其中一些水分子也参与了蛋白质功能的行使。球状蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多沟渠，多数球状蛋白的可及表面的面积约为同样大小的球的表面积的两倍。

球状蛋白二级结构的特征具有高度特异性和高度灵敏性。每种蛋白质分子都有特定的高级结构。这种构象的特异性，使它区别于其它类蛋白质；但这种高度特异的结构，并非固定不变，在执行生物学功能时，常常发生一系列的构象变化，表现出高度灵敏性。球状蛋白质分子的立体结构在生物体内，这些构象变化，往往是该蛋白质分子与配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受体的小分子激素和神经介质、血红蛋白的O2等。因此，生物体内的蛋白质是处于一种可以相互转变的多种构象的平衡态；球状蛋白质分子表面并不是光滑的，经常会出现一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周围常常是疏水性的：这些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白质(酶)的活性部位所在。化学物质的作用与蛋白质分子的构象硫氧还蛋白的结构紧密结合水亲水性残基疏水性残基第一节

化学物质对蛋白质的沉淀作用

Precipitationofproteinsbychemicals蛋白质的胶体性质

蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。

沉淀作用的类型可逆沉淀不可逆沉淀抗体-抗原沉淀在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。蛋白质在沉淀过程中结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，又称为非变性沉淀。在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，又称为变性沉淀。抗体和抗原蛋白通过相互识别和结合而发生的沉淀现象。这种特殊的沉淀作用是生物体免疫功能的基础。一、无机物沉淀二、沉淀剂的类型有机物沉淀盐析金属离子沉淀法等电点沉淀聚合物沉淀蛋白质水中的溶解度与其表面性质有关在水溶液中，蛋白质分子表面带有电荷基团：天冬氨酸、谷氨酸残基（含羧基）、组氨酸、精氨酸、赖氨酸残基（含氨基）；含有疏水基团形成区域：苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、缬氨酸等的侧链，在疏水区域的周围，水分子呈有序排列。1、无机物沉淀（1）盐析牢固结合水大量溶剂水层当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，开始，蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶。但当继续加入电解质时，另一种因素起作用，使蛋白质的溶解度减小，称为盐析。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。MelanderandHorvath理论分析蛋白质的盐析作用是由于静电作用引起的盐溶和疏水作用引起的盐析这两种作用相互作用的结果，盐析方程表示为lgS=lgS0-KsIS0代表当离子强度为零时的溶解度，S为蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度；I为中性盐的离子强度；Ks为盐析常数。对于蛋白质组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少蛋白质分子不对称性越大，越易沉淀。不同种类的盐对溶解度的影响与Ks值有关：Ks值较大，该盐的盐析效果好。含高价阴离子的盐，效果比1价的盐好。阴离子的盐析效果有下列次序：柠檬酸盐>PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-

但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸镁的效果不如硫酸铵。对于1价阳离子则有下列次序：

NH4+＞K+＞Na+最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。但硫酸钠在40C

以下溶解度较低，因而仅适用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上是HPO42-和H2PO4-的混合物，其作用比PO43+差。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定,在2-3mol/L(NH4)2SO4中酶可保存几年。同时由于盐的浓度高，可防止蛋白酶和细菌作用，故是最常用的盐析剂。硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高pH下会释放出氨，腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。常用的盐析剂一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类：第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的巯基相结合。（2）金属离子沉淀法在稀溶液中金属离子对蛋白质有效强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。在这些离子中，应用较广的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，Fe2+，Pb2+，Hg2+等较少应用，因为它们会使产品损失和引起污染。如Zn2+可用于沉淀杆菌肽(作用于第4个组氨酸残基上)和胰岛素；Ca2+(CaCO3)用于分离乳酸，血清清蛋白等。金属离子沉淀法的优点返回2、等电点沉淀蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。pH对

-乳球蛋白溶解度的影响

返回3、有机物沉淀有机溶剂酚类化合物及有机酸沉淀（1）有机溶剂利用和水互溶的有机溶剂使蛋白质沉淀的方法很早就用来纯化蛋白质。加入有机溶剂于蛋白质溶液中产生多种效应，这些效应结合起来使蛋白质沉淀。其中主要效应是水活度的降低。当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。在疏水区域附近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。

有机溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之间。当蛋白质的溶液pH接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。

有机溶剂沉淀法的优缺点（2）酚类化合物及有机酸沉淀当蛋白质溶液pH小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。一种多酚类化合物的寡聚体，它们的酚羟基可以解离而带有负电荷，而且分子中的苯环、多个羟基可以与蛋白质发生非共价相互作用，结合在蛋白质的表面。单宁单宁与蛋白质的相互作用模型在蛋白质分子之间形成多点交连而成网络结构，最终导致聚集而沉淀。4、聚合物沉淀非离子型聚合物沉淀法聚电解质沉淀法（1）非离子型聚合物沉淀法许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用来进行选