血红蛋白的提取和分离1

血红蛋白的提取和分离一、基础知识（一）凝胶色谱法：（也叫分配色谱法）根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。原理：所用凝胶实际上是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的。在小球体内部有许多通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。凝胶色谱法分离蛋白质的原理（二）缓冲溶液具有缓冲作用的溶液称缓冲溶液。缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变。一般由缓冲物质对构成，如：H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/NaHPO4作用机制：以H2CO3/NaHCO3为例A：当酸性物质（如乳酸）进入后，与溶液中的NaHCO3发生作用，生成乳酸钠和碳酸，而碳酸可以分解成CO2和H2O，CO2排出则PH不变；B：当碱性物质（如碳酸钠）进入后，与溶液中的H2CO3发生作用，形成NaHCO3，溶液PH不变。（三）电泳1、定义：是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。2、原理：许多大分子都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动；不同分子带电有差异，分子本身的大小、形状不同，在电场中产生不同的迁移速度，从而可实现样品中各种分子的分离。凝胶电泳原理示意图（四）血红蛋白在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。它由四个肽链组成，包括两个α—肽链和两个β—肽链。每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含血红素而呈现红色。二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。（一）样品处理1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为70）透析。红细胞的洗涤分离血红蛋白溶液有机溶剂无色透明的甲苯层脂类物质白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液红色透明液体红细胞破碎物沉淀暗红色沉淀物练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C