枇杷sco-pcr反应体系的建立及应用

枇杷sco-pcr反应体系的建立及应用

目标起点密码的多态性特征（scot）是2009年提出的一种新的目标遗传因素的分子标记。根据植物基因的atg，提取点侧翼序列的保守性，设计了单引用和抗渗阈值，并在行频带中扩展了各组。是一种能跟踪性状的新分子标记技术。已被成功应用于单子叶植物水稻和双子叶植物花生。多倍化是植物进化过程中普遍存在的一种自然现象,被认为是植物进化和物种形成的主要驱动力,而多倍体育种也一直是新品种选育和遗传改良的重要途径,在农业生产中发挥重要作用。枇杷原产我国,其果实柔软多汁,营养丰富,又在初夏水果淡季上市,越来越受到消费者的喜爱和研究者的重视。前人对枇杷的研究主要以二倍体为主,在枇杷多倍体研究中,张凌媛等曾统计分析了枇杷气孔保卫细胞叶绿体数目与倍性的相关性,汪卫星则利用IS-SR、AFLP、GISH和MSAP等技术,对天然与人工合成三倍体枇杷基因组变异及其DNA甲基化进行了分析,而对于更多倍性枇杷植株的研究则鲜有报道。我们以多倍体枇杷为材料,利用正交设计方法对影响SCoT-PCR反应体系的主要因素进行优化,以期建立适宜的SCoT分析体系,为多倍体枇杷的遗传育种等研究提供新的技术支持。1材料和方法1.1材料和引物的筛选以4个枇杷品种的11个不同倍性株系泸州六号(2x,3x,4x,5x),龙泉1号(2x,3x,4x),早红3号(2x,3x,4x),软条白沙(3x)为材料,其中软条白沙3x用于枇杷SCoT-PCR体系的优化和引物筛选。以上材料均定植于西南大学果树学重点实验室试验基地。所用SCoT引物序列来自于Collard等(表1),由上海生工生物工程有限公司合成。DL2000Marker,dNTPs,TaqDNA聚合酶,10×Buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司。1.2蛋白酶kk-异戊醇的制备枇杷基因组DNA提取采用改良CTAB法,具体步骤为:取1g左右的枇杷嫩叶于液氮中充分研磨后转入10mL离心管中,加入4mL去糖缓冲液,10000r·min-1,离心15min,弃去上清。然后加入3mL65℃预热过的2%CTAB提取缓冲液和30μL的蛋白酶K(10g·L-1),65℃水浴1h,其间轻轻颠倒几次。水浴结束后加入1/3体积(约1mL)4℃预冷的KAc(5mol·L-1),冰浴20min。再加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1),充分混匀,10000r·min-1,离心15min。重复抽提2次。加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,用自制玻璃钩将絮状沉淀勾出,75%乙醇漂洗2次,无水乙醇漂洗1次,干燥。加入400μLddH2O溶解。纯化时加入5μLRNA酶(10g·L-1),37℃保温1h,纯化产物溶于100μLddH2O,-20℃保存备用。1.3扩增程序的改进PCR扩增反应在eppendorfMastercyclerPCR扩增仪上进行。参考Collard等和陈虎等的程序,有改进,本实验中采用的扩增程序为94℃预变性4min;94℃变性1min,51.8℃退火1min,72℃延伸2min,循环36次;72℃延伸10min。扩增反应结束后,加入2μL6×Loadingbuffer,取8~10μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,紫外灯下照相。1.4倍体植株dna及pcr扩增选用L25(56)正交试验设计(表2)。用软条白沙三倍体植株DNA为模板,SP12为扩增引物,每个处理重复3次。各处理总体积为20μL,每个处理的10×Buffer用量均为2μL,不足用ddH2O补足。1.5个温度梯度根据正交试验结果选择最佳反应体系对退火温度进行梯度试验,设定12个温度梯度:45℃、45.1℃、45.7℃、46.6℃、47.7℃、49℃、50.4℃、51.8℃、53℃、54.1℃、55℃、55.4℃。除退火温度不同外,反应程序与正交试验时相同。2结果与分析2.1+、引物、taq酶检测从正交试验扩增结果电泳图可以看出25个组合均能扩增出条带,只是条带数量及条带的清晰度有所不同(图1)。其中组合14和15扩增的条带分散最好,也最清晰。根据桂腾琴等的方法,对实验结果进行评分和统计分析(表3)。直观分析结果中极差R反映了各个因素对反应体系的影响程度,试验中5个因素对PCR反应体系的影响由大到小依次为:dNTPs>Mg2+>模板DNA>引物>Taq酶。而根据各个因素水平下的数据平均值ki得出的适宜PCR反应体系与处理组合15和14最为接近,其中与组合14的dNTPs和引物有所差异,与组合15的模板DNA用量有所不同。通过引物、dNTPs、模板DNA3个因素的效应曲线图(图2)可以看出:引物浓度在0.5μmol·L-1和0.625μmol·L-1水平间差异表现并不显著,结合经济角度考虑,选用0.5μmol·L-1作为引物的最佳用量;dNTPs用量在0.25mmol·L-1和0.35mmol·L-1水平间有较明显的差异,从图1也可看出,dNTPs的浓度为0.35时扩增条带更加清晰完整,因此,选用0.35mmol·L-1为dNTPs最适浓度;模板DNA用量从10ng到50ng与结果均值成正相关,在50ng和10ng水平间有显著差异,所以,选用50ng作为反应体系的最佳模板DNA用量。故适合的枇杷SCoT-PCR反应的最佳体系为:模板DNA50ng,dNTPs0.35mmol·L-1,Mg2+1.5mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,Taq酶0.5U,总体积为20μL。2.2温度对电泳结果的影响利用正交设计得到的枇杷SCoT-PCR优化体系进行适宜退火温度的筛选。由图3可以看出当退火温度为45℃时只有一条扩增条带,当退火温度为45.1~50.4℃时,电泳结果显示有杂带出现,使条带模糊,分散不清,不利于分析。温度超过53℃时条带开始减少,特异性增强,但扩增效果不太理想。只有在51.8℃时条带最为清晰,所以引物SP12的最佳退火温度为51.8℃。2.3scct-pcr体系和熔喷sco利用优化的反应体系和最适退火温度对32个SCoT引物进行扩增,结果显示32个引物均能扩增出清晰的条带,扩增条带数多为2~10条,片段大小在150~2000bp,并且分散良好,便于统计分析(图4)。说明筛选的SCoT-PCR体系和51.8℃的退火温度适于不同引物的扩增。选取2个引物SP20,SP27分别对泸州六号(2x,3x,4x,5x),龙泉1号(2x,3x,4x),早红3号(2x,3x,4x)3个品种的10个不同倍性株系进行SCoT-PCR扩增,2个引物对不同倍性枇杷基因组DNA的扩增图谱清晰,多态性丰富,说明获得的SCoT–PCR反应体系稳定,重复性高,扩增效果良好,适用于多倍体和二倍体枇杷的遗传分析。3多倍体scct-pcr反应体系的改进根据不同分子标记技术产生的标记基因组来源将分子标记分为三类:随机DNA分子标记(RDMs)、目的基因分子标记(GTMs)和功能性分子标记(FMs)。RDMs已在分子生物学等领域得到了广泛应用,FMs的开发需要知道已鉴定出功能的基因序列信息,因而它尚没有被广泛开发出,只限于少数几种植物当中,因此,除随机DNA分子标记外大多数开发出的分子标记属于目的基因分子标记一类。SCoT标记是一种新型目的基因分子标记,其具有操作简单,重复性好,能有效产生和性状连锁的标记,并且引物可以在物种间通用等优点。但是由于不同的材料所适用的反应体系不同,任何一个反应因素的过少或过量都会对反应结果和扩增效果产生很大的影响。因此,在将这种新的标记应用于新的材料时需要对相应的扩增体系进行优化。利用正交设计方法,对SCoT-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板DNA等主要因素以及退火温度进行了优化和筛选,发现dNTPs和Taq酶浓度分别是对枇杷SCoT-PCR反应影响最大和最小的因素,这与付燕等关于枇杷IS-SR反应中影响程度Mg2+>Taq酶>引物>模板DNA>dNTPs的结果相差较大,可见,即使有许多相似之处的不同标记技术在同类材料上应用所适用的反应条件也有很大差异。筛选出的最适退火温度51.8℃与Collard等在水稻上应用的50℃有所不同,但都可以作为不同引物的共用退火温度。改进的反应程序也能很好的完成PCR的扩增。通过在不同倍性枇杷上的初步应用,证明所建立的多倍体枇杷的SCoT-PCR优化体系扩增条带清晰,效果良好,便于分析。在许多园艺植物中,多倍体育种一直受到研究者的重视,枇杷也不例外,作者所在的实验室已经通过实生筛选、杂交和生物技术等方法获得了数百株多倍