酶的分离纯化

第三章酶的分离纯化内容概述破碎与提取沉淀法层析分离电泳其它分离方法酶的剂型与保存细胞结构与酶分布第一节概述一、酶分离纯化的一般原则：1.切记酶是蛋白质，防止酶变性失活1)酶纯化一般在低温条件下进行（0～4℃），2)各种溶液应该用缓冲液，pH应调到使酶最稳定的pH。3)各种溶液中还可以加入酶保护剂。2建立一个可靠和快速的测活方法 方法专一、灵敏、精确、简便、经济3.酶原料的选择 选择目的酶含量丰富的原料，且考虑原料的来源、取材方便、经济等因素。4.酶的提取5.酶的提纯产率=(目的酶的总活力/粗抽提液中目的酶总活力)*100%反映提纯过程酶活力的损失情况提纯倍数=目的酶的比活力/粗抽提液中目的酶比活力提纯方法的效率

总体积(ml)蛋白浓度(mg/ml)蛋白总量(mg)酶浓度(u/ml)比活力(u/mg蛋白)总活力(u)产率(%)提纯倍数粗无细胞抽提液1000121200050.41650001001.0硫酸铵分级2503750113.672730558.83凝胶层析25983离子交换层析573646.酶的纯度检验当把酶提纯到一恒定的比活时，即可认为酶已纯化，仍需电泳、层析、离心等方法对纯化的酶进行纯度检验。酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。二、酶纯化过程的三个阶段粗蛋白(crudeprotein)采样破细胞提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。部分纯化(partiallypurified)初步的纯化，使用各种柱层析法。均质纯化(homogeneous)目的酶的进一步精制，可用制备式电泳或HPLC。

第二节破碎与提取一、生物材料的破碎细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理1.动、植物材料

绞肉机切碎，高速组织捣碎机，加砂研磨2.微生物材料霉菌材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶解酶解决。细菌，少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。酵母细胞壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的办法有：(1)细胞壁溶解酶处理法；(2)盐振荡法；(3)冷热破壁法。二、抽提细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：

普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。

抽提条件的选择：一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。需要考虑的因素pH不应超出酶的稳定范围；远离待抽提酶的等电点。兼顾到有利于切断酶和细胞内其它成分间可能的联系，从这点考虑以选用pH4—6为佳。2.盐大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以抽提液一般采用等渗盐溶液。最普通的加0.020—0.050M的磷酸缓冲液、0.15MNaCl等。少数情况用水抽提效果亦佳.3.其它在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。为此，有时还需要在抽提液中加入某些物质。4.抽提液的用量：通常采用原料量的l—5倍，有时为了抽提效果好些，要反复抽提，液量可能大些。5.固体成份除去：抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多可用离心法或压滤法除去。纯化方法的选择1.为了获得理想的分离效果应注意：工作前应对所要纯化的酶的理化性质(溶解度、分子大小和解离特性)以及酶的稳定性等有一个较全面的了解。判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。要严格控制操作条件，防止变性。2酶的物理化学性质建立的一般方法：1）溶解度：盐析

有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 共沉淀法 PEG沉淀法、

等电点沉淀法2）分子大小差异：凝胶过滤超过滤离心超离心3)

电学、解离特性差异：吸附

离子交换电泳（区带、等电聚焦）聚焦层析疏水层析高压层析(HPLC)4)

稳定性差异：选择性热变性

选择性酸碱变性选择性表面变性5）特殊基团差异:亲和层析有的方法是建立在上述二个功能同时起作用。第三节沉淀分离通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理

盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离1.盐析法是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。1)盐析法的原理：根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。2)产生盐析作用的原因等电点与环境PH的关系提高盐浓度增加蛋白质的溶解度盐溶一个是由于盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合，形成离子对，盐离子部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。另一个原因是由于中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露了疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。3)盐析剂的选择就阳离子来说，一价盐通常比二价盐有效；阴离子则相反，二价盐比一价盐好。符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。硫酸铵最常用。硫酸铵沉淀优点溶解度大，溶解的温度系数小(0℃，706克／升；25℃，767克／升)；稳定性好，高浓度低温对蛋白构象有稳定作用；低格低廉，可大量使用。饱和度调整加入固体盐。不增大溶液体积。饱和溶液。原溶液体积不大。透析平衡法4)影响盐析的因素(1)pH接近于待纯化酶的等电点。(2)温度从酶的稳定性和溶解度看，盐析温度一般以控制在30℃左右为宜。(3)蛋白质浓度蛋白浓度应在1mg／ml以上

5)盐析法的特点优点：简便、安全(大多数酶在高浓度盐溶液中相当稳定)、重现性好。缺点：分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化有时还需脱盐。2.有机溶剂沉淀法原理:不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。降低溶液的介电常数，蛋白质分子问的引力增加，溶解度降低。部分地引起蛋白质脱水而沉淀。有机溶剂沉淀法应考虑的因素(1)温度操作过程通常应控制在0℃以下。而且有机溶剂必须预先冷却到-15—--20℃。(2)pH尽可能靠近待纯化酶的等电点pH条件下进行。(3)离子强度

添加适当浓度的中性盐，如5—10％的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。(4)有机溶剂

丙酮的分离效果一般最好,乙醇和甲醇等也常用。优缺点分辨率高于盐析法，不用脱盐对酶容易引起变性失活，故对温度要求严格。共沉淀法

等电点沉淀法选择性沉淀法第四节层析分离一、概述1.1定义层析分离是利用混合物中各组分的物理化学性质的不同，使各组分在两相中的分布不同而达到分离。层析中两相为流动相和固定相，当流动相流经固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组分分离纯化。1.2发展纸层析薄层层析柱层析样品容量不断增大1.3基本原理1.4分类按流动相分类，有液相层析和气相层析；按固定相的形式分类，有柱层析、薄层层析等按分离过程物理化学原理：分配、吸附。层析分离方法层析方法分离依据吸附层析吸附剂对不同物质的吸附力不同分配层析各组分在两相中的分配系数不同离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的结合力不同凝胶层析利用流动相中各种组分的相对分子质量不同亲和层析利用生物分子与配基之间的专一而又可逆的亲和力不同层析聚焦两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起二、吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，是应用最早的层析技术。三、分配层析：各组分在两相中的分配系数不同分配系数：溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。纸上层析分配薄层层析分配气相层析薄层层析四、凝胶过滤(层析)法1.原理凝胶具有孔，小分子物质进入凝胶内部，大分子物质被排阻在外。当混合溶液通过层析柱时，样品中的各种分子按其分子大小不同而分离.常用的凝胶：

葡聚糖凝胶

琼脂凝胶与琼脂糖凝胶

聚丙烯酰胺凝胶

2.胶的选择由亲水的线状聚合物通过交联剂交联、或通过聚合物自身缔合组成具有网眼结构的胶粒物质。葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶

分配系数五、离子交换层析是重要而广泛应用的层析方法。以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。基本原理：离子交换剂在水中呈不溶解状态，能释放出反离子，同时与溶液中的其它离子或离子化合物相互结合，结合后本身理化性质保持不变。1.基本原理纤维素－O－CH2－COO-Na+

基质电荷基团反离子2.离子交换剂的分类A疏水性离子剂：基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂物质。常用的是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，然后以共价键方式引入不同的电荷基团，按电荷基团的性质可分为阳离子交换剂(反离子带正电)和阴离子交换剂(反离子带负电)，每种包括强、中、弱三种电荷基团。B亲水性离子交换剂基质是天然的或人工合成的，与水结合力较大的物质。常用的有：纤维素离子交换剂、交联葡聚糖离子交换剂、琼脂糖离子交换剂。离子交换剂的选择依据首先是待分离酶(或蛋白)的稳定性酶在低于其pI的pH条件下稳定，可选在相同的条件下，pI>pH时，pI越高，越容易被运用酶在低于其pI的pH条件下稳定，可选在相同的条件下，pI>pH时，pI越高，越容易被试设计利用离子交换剂分离一种含等电点分别为4.0、6.0、7.5和9.0的蛋白质混合液的方案，并简述理由。强型和弱型交换剂的选择如果待分离酶的pI偏向极端(小于6或大于9)一般应考虑强型交换剂。如果待分离的酶既可应用强型交换剂，也可用弱型交换剂，但是酶不稳定，此时应优先考虑选择弱型。六、亲和层析法亲和层析法是据生物分子间某种特有的亲和力而建立的一种新型纯化方法。1.原理:酶和它的底物(包括辅助因子)、底物类似物或竞争性抑制剂通常都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶—配基络合物。将这类配基偶联固定于样品中，那么，它就能迅速而有选择性地将相应的酶分子从溶液中分离出来。常用的亲和介质及专一性配体根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：

共价亲和层析 疏水层析 金属离子亲和层析 免疫亲和层析 染料亲和层析 凝集素亲和层析

第五节电泳一、原理根据各种蛋白质解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度不同而进行纯化的一类方法。特点:这类方法可以达到很高的分辨效果1分类(1)自由界面电泳

需要复杂的设备，而且待分离物质往往不能完全