健脾化痰、活血通络与补肾壮骨对激素性股骨头坏死形态学影响的比较研究

健脾化痰、活血通络与补肾壮骨对激素性股骨头坏死形态学影响的比较研究

骨坏死是由骨活性物质（骨细胞、骨髓血浆细胞和脂肪细胞）引起的最重要的病理过程。随着激素的广泛运用和诊断技术的提高,激素性股骨头坏死的发病率已超过创伤性股骨头坏死,成为目前骨科最常见的继发性疾病和世界难治性疾病。我们在前期的中医临床实践中,曾应用健脾化痰、活血通络和补肾壮骨、活血通络方药治疗激素性股骨头坏死取得了较满意的效果。为了进一步明确相关作用机制,本研究观察比较了这两种不同治法对鸡激素性股骨头坏死的骨组织形态学的影响。1材料和方法1.1实验动物健康来航鸡,SPF级,雌性,1.80~2.30kg,由北京梅里来维通实验动物技术有限公司提供。1.2不断补充中药-血药浓度法简称后期管理健脾化痰、活血通络组(简称健脾组)方药组成:茯苓15g,桂枝10g,白术12g,生甘草8g,太子参20g,法半夏10g,桃仁15g,红花10g,当归10g,川芎10g,赤芍12g,生地15g,威灵仙15g,伸筋草15g。补肾壮骨、活血通络组(简称补肾组)方药组成:鹿角胶20g(烊化),补骨脂15g,肉桂10g,杜仲15g,菟丝子15g,地龙10g,当归10g,桃仁12g,红花10g,川芎8g,赤芍12g,苏木15g,土鳖虫10g,延胡索15g,自然铜15g(煅),骨碎补15g,北黄芪30g。两组方药均由中国中医科学院中药研究所提供,制备成含生药1g/ml的药液。甲基氢化泼尼松琥珀酸钠购自比利时法玛西亚普强公司,每支40mg/ml(批号:LH1208)。1.3动物的给药与剂量健康来航鸡64只,随机分4组:正常组、模型组、健脾组和补肾组,每组16只。参照王心生等激素性股骨头坏死造模方法改良,除对照组注射生理盐水,其他组均于胸肌注射5.2mg/kg(相当于临床1.4倍)的甲基氢化泼尼松,每周1次,连续16周。健脾和补肾组分别同时给予健脾化痰、活血通络方药(每日6ml/kg)和补肾壮骨、活血通络方药(每日9ml/kg)灌胃,每周给药6次,共16周;正常和模型组则灌胃给予生理盐水。所有动物均肌注青霉素(2万U/kg)和链霉素(50mg/kg)以预防感染,每周2次。选取8周和16周2个时点,每组每个时点各处死8只动物,取双侧股骨头固定备用。1.4观察指标1.4.1一般情况下观察记录给药期间动物的体重、精神、活动、步态、毛发、大小便等情况;取材时观察股骨头形状、关节软骨色泽及质地。1.4.2he和ma法律法规染色HE染色观察空骨陷窝、脂肪面积情况,Masson染色观察胶原情况。方法:将股骨头置于4%多聚甲醛溶液中固定48~72h,然后用12.5%的EDTA-2Na溶液脱钙,梯度乙醇脱水,常规石蜡包埋、切片(厚度5μm),进行HE和Masson染色。光镜下观察HE染色后股骨头骨细胞、骨小梁、软骨细胞、髓内脂肪细胞等结构;高倍镜下随机选取5个视野,每个视野内计数50个骨陷窝,计算空骨陷窝的百分比;Masson染色后,光镜下观察骨小梁及软骨内不同类型胶原分布情况。采用SPOT4.0MIS图像处理分析系统,分析脂肪面积和胶原面积的百分比。1.5统计分析2结果2.1动物青少年股骨外观和体重变化正常组观察期间体重无明显变化,各种体征表现正常。给予激素造模后,模型组鸡体重持续下降,8周时股骨头外观未见明显异常;16周时2例出现股骨头软骨下骨塌陷,部分动物骨质疏松、易凿切,骨髓脂肪增多。健脾组动物体重无明显下降,股骨头外观接近正常组。补肾组在给药1~6周体重下降,自6周以后状态逐渐改善,15周末体重接近给药前水平,股骨头外观亦接近正常组。2.2骨小梁及髓内脂肪细胞正常组鸡股骨头软骨细胞排列整齐,骨小梁排列规则、致密、饱满,周边可见成骨细胞和少量破骨细胞,髓内造血细胞丰富,未见脂肪细胞增生及肥大。造模8周时,模型组鸡股骨头软骨细胞呈簇状肥大,排列不规则;骨小梁稍稀疏,空骨陷窝增多,成骨细胞较少,破骨细胞增多,但差异无统计学意义;髓内脂肪细胞明显增生、肥大,造血细胞减少。16周时模型组鸡股骨头骨小梁稀疏,有断裂,部分区域坏死伴增生,空骨陷窝进一步增多,达27%;髓内脂肪细胞增生、肥大,部分融合成大片空泡状,脂肪面积较正常组明显增多。健脾组软骨细胞排列整齐,骨小梁排列尚规则、致密,周边可见大量成骨细胞及少量破骨细胞,空骨陷窝量较少;髓内造血细胞丰富,脂肪细胞较少。补肾组骨小梁较致密、饱满,见少量小面积坏死区域,坏死区周边可见成骨细胞包绕及类骨质形成,16周时空骨陷窝率明显少于模型组;髓腔内脂肪细胞零散分布,髓腔内造血细胞较丰富。健脾组、补肾组在实验8周和16周髓内脂肪面积均比模型组明显减少(见图1和表1)。2.3小鼠软骨胶原面积、绿染面积进行Masson染色后,光镜下观察,正常组内绿染少、红染多,胶原纤维排列层次清晰。造模8周时模型组较正常组内软骨胶原面积稍增多,两治疗组与模型组相比均有所降低,但差异无统计学意义。造模16周后,模型组骨小梁周边可见大量绿色胶原,与正常组相比,其绿染面积明显增多;健脾和补肾组骨小梁周边可见少量绿色染色,骨小梁内绿染区与模型组相比明显减少,以红染为主,胶原层次较清晰(见图2和表2)。3讨论3.1患者的骨髓脂肪化借助Masson染色,观察了模型鸡股骨头内胶原的变化情况。成熟骨Masson染色胶原着鲜红色,在新生骨走向成熟过程中表现为红-绿相间现象,而绿染区的则代表不成熟胶原。使用激素8周时,模型组出现了骨髓脂肪化表现,至16周时不成熟胶原才明显增多。提示了在实验性激素性股骨头坏死的组织病理学变化过程中,首先出现的是骨髓组织的脂肪化,然后才出现不成熟胶原增多,进而发生骨组织坏死。也说明了激素不仅导致骨髓脂肪化,还抑制了骨组织的有效修复。其原因可能是激素直接诱导骨髓基质细胞分化成脂肪细胞,脂肪组织堆积引起骨内高压,同时成骨分化减少,骨修复过程缓慢,最终发生股骨头坏死。3.2补骨脂,增强血管内凝血功能研究证实,健脾化痰中药对血清总TG、TC、LDL﹣c含量均有明显调节作用,方中苍术含有与钙磷吸收有关的维生素D,其挥发油具有促进骨骼钙化作用;茯苓具有增强机体免疫功能,对抗可的松引起的巨噬细胞功能抑制;桂枝可扩张血管,调节血液循环;红花、当归、川芎、赤芍等,能明显改善血浆黏度,减轻血液高黏滞状态,减少血管内凝血,从而最终抑制激素性股骨头缺血性坏死的发生和发展。现代药理学研究表明鹿角胶促进钙的吸收,降低毛细血管通透性,使渗出减少;补骨脂对成骨细胞增殖具有显著促进作用;自然铜药液中含有大量锌、钢、铁、锰、钙等元素,有利于胶原合成,提高赖氨酸氧化酶的活性,使胶原纤维韧性加强,从而增强骨的生物力学强度,促进新骨生成;骨碎补有预防血清胆固醇、甘油三脂上升,并能促进骨对钙的吸收,提高血钙和血磷水平,有利于骨修复。3.3激素性股骨凋亡的临床病理依据在激素性股骨头坏死早期,或在“治未病”的预防阶段,除了活血通络,是加强补肾壮骨还是侧重健脾化痰,是一个值得探索的问题。本研究结果表明两种治法方药对激素性股骨头坏死均有较好的防治作用,其减轻骨髓内脂肪面积及不成熟胶原面积的总体效果相近,但降低骨陷窝率的作用与特点略有差别。相对而言,健脾组发挥药效的时间更早,实验8周时股骨头内空骨陷窝数减少,肉眼未见股骨头坏死变形,而补肾组到实验16周才表现较明显的骨组织形态学改善作用。这两种治法方药均能不同程度阻止由激素诱导的骨髓脂肪化,改善股骨头内微循环障碍,同时拮抗激素对成骨修复的抑制作用,加速骨坏死的有效修复。本研究显示健脾化痰、活血通络和补肾壮骨、活血通络两种不同治法方药均能在一定程度上减轻激素性股骨头坏死的组织形态学改变。相比之下,健脾化痰、活血通络方药发挥药效的时间更早,相关机制有待进一步的研究阐明。采用SPSS13.0软件进行数据分析,正常组、模型组组间比较采用Independent-SamplestTest,模型组、健脾组、补肾组组间比较用单因素方差分析(one-wayANOVA)的LSD模块统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。中医并无股骨头坏死的病名,但可将其归于“骨蚀”、“骨痹”、“骨痿”等范畴,病机主要涉及痰、瘀、虚等方面。受“肾主骨”理论的影响,诸多学者多从肾论治,尤其是久病致虚,必当补肾。而在近年的临床研究中,发现激素性股骨头坏死早期的中医证候规律主要表现为“痰瘀互结”:脾主运化,为生痰之源,外邪损伤正气时,脾胃虚弱,运化失司,则痰浊内生,由痰致瘀,痰瘀同病,“痰瘀”可能是激素性股骨头坏死的病理转归和核心。实验研究也证实,高脂血症与高凝状态并存的病理特征是中医学“痰瘀互结”理论在股骨头坏死病机中的具体体现,血管内凝血和脂质代谢紊乱及其相关因素是激素性股骨头坏死“痰瘀同病”的病理基础。本组