紫色毛霉发酵大豆的抗氧化能力研究

紫色毛霉发酵大豆的抗氧化能力研究

不仅含有丰富的养分，还包含许多具有生理功能的活性物质。腐乳具有较好的生理功能,已见报道的有抗氧化、降血压、降胆固醇等作用。目前在腐乳生产过程中,毛霉菌种的开发集中在常温菌种,例如:雅致放射毛霉,总状毛霉。但是,在我国一些气温相对较低的地区,如东北地区,可采用低温型的菌种,如黑龙江省依安县的一些腐乳加工作坊,就利用当地的低温气候,进行粗旷的腐乳生产,即通过将简单保存的菌丝体制成菌悬液,喷洒在白坯表面,在室内约12℃发酵5d,然后盐腌、后酵、成熟。二苯代苦味酰基自由基(DPPH:2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate)及2,2-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[ABTS:2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)]自由基清除试验方法是检测受试物抗氧化作用的常用方法。笔者分离出该腐乳的生成用菌,与腐乳生成常用菌-雅致放射毛霉对比,比较两者生产得到的腐乳之间抗氧化能力的差异。1材料和方法1.1试剂与仪器黄色毛霉:腐乳菌丝体中分离纯化;大豆(科丰六号):河北海兴种子公司;雅致放射毛霉(编号AS3.227):中国工业微生物菌种中心;ABTS[2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)]、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrate)、Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic):美国Sigma公司;其他试剂:分析纯,上海化学试剂有限公司;FA1004型电子天平:上海天平仪器厂;TCL-16C型台式离心机:上海安亭科学仪器厂;FDU-54型冷冻干燥机:东京理化器械株式会社;550型96孔微板酶标仪:日本Bio-RadLaboratories公司;WD4005型生化培养箱:哈尔滨东明医疗仪器制厂;I204型紫外分光光度计:日本岛津公司;GL-20B型高速冷冻离心机:上海安亭实验仪器厂。1.2测试方法1.2.1制作腐败材料(1)水磨浆的加热称取挑选后的大豆800g,清洗3遍,加入2000g蒸馏水室温下浸泡至豆粒饱满,除去没有被完全吸收的水分。8倍于大豆重量的水磨浆后,用通电加热设备加热至95℃,保持5min。称取5000g熟豆浆冷却至80℃,在80℃水浴锅保温10min后,搅拌中加1mol/L的氯化镁溶液98mL,静置蹲脑20min,用100×70×70的塑料敞口容器作为成型盒,先在3724Pa压力下加压10min,后在7448Pa压力下加压40min,降温后切块尺寸为30×30×10的白坯。(2)射毛霉接种量在豆腐白坯上分别接种黄色毛霉和雅致放射毛霉,接种量均为106个孢子/g。在温度13℃和相对湿度90%的条件下培养84h后,经过搓毛工序即为毛坯。(3)酵母粉添加量d在玻璃容器中放入毛坯,加入毛坯质量15%的盐,腌制5d即为盐坯。添加后酵汤料包含有15%乙醇和6%盐,封口。放于培养箱中,温度为25℃湿度为75%。,发酵60d后得到黄色毛霉发酵腐乳和雅致放射毛霉发酵腐乳。1.2.2粉末解压剂发酵成熟(后酵时间60d)的黄色毛霉发酵腐乳和雅致放射毛霉发酵腐乳,真空冷冻干燥后,研磨成粉末用于分析,样品粉末置于4℃冰箱中保存。称取1.000±0.005g冻干样品粉末,加入10mL蒸馏水后,均质(16000r/min,20s),在室温下振荡提取2h后,3000r/min下离心20min,取上清液重新离心4000r/min,20min,上清液为样品溶液(浓度为100mg/mL)用于测定,样液4℃保存备用。1.2.3乳酸水提取与dpph法DPPH自由基清除能力的测定方法参考Shimadak的方法。腐乳水提取液的制备:将1.2.2中样品液,用水逐级稀释7个浓度,分别为30,25,20,15,10,5,2.5mg/mL。取不同浓度的腐乳水提取溶液1mL与1mLDPPH乙醇溶液(0.2mM)混合,20min后,在波长为517nm下,用紫外分光光度计测定吸光值,每个浓度做3个平行样,测量后取平均值。计算清除率。清除率=[1-(A样品/A样品空白)]×100%式中:A样品——加提取液反应后DPPH溶液吸光度;A空白——用水代替提取液反应后DPPH溶液吸光度。1.2.4abts清除活性的测定ABTS自由基清除能力的测定采用Roberta的方法改良进行,ABTS液的配置:用蒸馏水配置7mM的ABTS溶液,用蒸馏水配置140mM的高硫酸钾溶液,分别取20mLABTS溶液和352μL高硫酸钾溶液混合过夜之后,用乙醇将混合液稀释至吸光值OD734为0.700±0.005,备用;将1.2.2中样品液,用水逐级稀释6个浓度,分别为10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125,0.156mg/mL。取不同浓度腐乳提取液(样品液),在96微孔板中,按表1加样。在加入ABTS液20min后,在波长为405nm下,用96孔微板读数器测定吸光值A。计算清除率。清除率=[1-(A样品-A样品空白)/(A阳性对照-A阴性对照)]×100%1.2.5抗氧化能力的测定取4mL的亚油酸乳化液(亚油酸2.51mL,乙醇100mL,0.05MpH7.0磷酸缓冲液8mL与3.9mL蒸馏水混合后超声振荡30min)与0.05mL样品液(样品液,BHT的浓度都为2mg/mL)在透气试管中混合,放置于40℃培养箱中。每隔24h取出样品不同浓度腐乳提取液0.1mL,依次加入75%乙醇溶液2mL,30%(W∶V)硫氰酸铵0.1mL,20mmol/L氯化亚铁0.1mL,室温下反应3min后,测定其在500nm下的吸光值。吸光值越低表示样品抗氧化能力越强,试验以BHT为标准品。每组为3个平行样,测量后取平均值。1.2.6样品还原能力测定腐乳提取液还原能力的测定方法参考Yencc的方法。将1.2.2中样品液,用水逐级稀释6个浓度,分别为100,60,30,15,7.5,3.75mg/mL。取0.4mL不同浓度腐乳提取液,加0.4mL0.2M磷酸缓冲液(pH=6.6)及1%铁氰化钾0.4mL于2mL离心管中混合均匀后,于50℃下静置20min,再加0.4mL的10%三氯乙酸,混合后离心(6000g,10min)。取上清液1mL,加1mL蒸馏水和0.1%的三氯化铁溶液0.2mL混合均匀,室温下反应10min后,测定其在700nm下的吸光值。吸光值越高表示样品还原能力越强,试验以BHT为标准品。每组为3个平行样,测量后取平均值。2结果与讨论2.1dpph自由基清除能力黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的DPPH的清除能力见图1,ABTS清除能力见图2。图1中黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳表现出较好的DPPH自由基清除能力,在浓度为30mg/mL的时候两者的DPPH清除率分别为98.24%和82.36%。从结果上来看,黄色毛霉腐乳DPPH清除能力高于雅致放射毛霉腐乳的DPPH清除能力。图2反映了黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的ABTS的清除能力。黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的ABTS清除能力也存在差异,在相同浓度(2.5mg/mL)下黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的ABTS清除率分别为76.25%和69.39%。在浓度为10mg/mL时,两种腐乳的ABTS清除率分别为82.44%和82.81%,无显著性差异。黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳具有一定的ABTS自由基清除能力。此DPPH、ABTS抑制试验证实,腐乳具有很好的自由基清除能力,并且黄色毛霉腐乳的自由基清除能力略高于雅致放射毛霉。2.2提取液和提取液对d黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳在亚油酸系统中的抗氧化能力见图3。对照组(不添加任何抗氧化剂)中,亚麻酸的过氧化程度在6d的孵育过程中明显升高,各个时期的示数都高于试验组。添加有BHT、黄色毛霉腐乳提取液和雅致放射毛霉腐乳提取液的亚油酸在6d的氧化过程中,过氧化程度增加幅度较小。试验的第6天,它们的亚油酸氧化抑制率分别为46.5%,30.2%和22.6%,说明三者都可以抑制亚油酸的过氧化,且黄色毛霉腐乳的亚油酸氧化抑制能力强于雅致放射毛霉腐乳提取液的抑制能力(p<0.05)。2.3还原力的测定黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的还原能力见图4。黄色毛霉发酵腐乳和雅致放射毛霉发酵腐乳的还原能力皆随着浓度的升高而增加,浓度跨度为4～100mg/mL,还原能力的变化分别由0.195升至2.543,0.190升至2.553。标准品BHT的剂量在达到1mg/mL时其还原力到达最高值且呈现稳定状态。在相同浓度(100mg/mL)时,BHT,黄色毛霉腐乳和雅致放射毛霉腐乳的还原能力分别为2.934,2.543和2.553。结果表明:黄色毛霉腐乳与雅致放射毛霉腐乳的还原能力相比,没有显著性差异(p<0.05)。腐乳提取物的还原能力在低浓度时显著的低于BHT,但在提高浓度的情况下,几乎可以达到与BHT相当的还原能力。说明腐乳提取物可以凭借其还原能力,作为电子供体与自由基反应,使之转换为更稳定的物质,从而达到中断自由基链式反应,起到抗氧化的作用。3自由基清除能力毛霉腐乳和黄色毛霉腐乳