发酵豆渣中添加黑曲霉的菌株筛选及安全性评价

发酵豆渣中添加黑曲霉的菌株筛选及安全性评价

中国是一个传统的食用肉类大国。随着对大豆营养的深入理解，其国民消费也在增加。作为传统大豆生产的副产品，豆渣每处理1吨大豆产生2.5万吨豆渣。目前，中国每年约有1500万吨豆渣。中国的大豆蛋白含量很高，适合生产蛋白质，如豆腐等。因此，政府对未来中国的豆场产业结构提出了指导意见，这将有助于以后的非压缩行业。随着豆渣的增加，由于口感粗糙，水分含量高，容易腐败，耐储存，因此大部分用于饲料和直接浪费，食用不足，造成资源浪费。豆渣含有丰富的蛋白质、Ca等矿物质和其他营养成分,另外还富含膳食纤维,对于预防肠道癌变、便秘、减肥具有良好功效.不仅如此,近年来研究还发现,发酵豆渣具有抗氧化、降低血液中胆固醇含量、减少糖尿病患者对胰岛素的消耗等功效.目前豆渣在食品工业中主要有两种利用途径:一是烘干粉碎后作为添加辅料用于食品加工,如膨化食品、烘烤食品;二是以豆渣为原料提取豆渣中的保健功能成分如膳食纤维等.但干燥豆渣能耗大,另外豆渣颗粒大也直接限制了豆渣在食品中的添加量;而提取过程中需要经过酸碱等多种工序处理,易造成环境污染,也不利于豆渣的有效利用.改善豆渣口感需要使豆渣粒径变小.目前,减小豆渣粒径主要为机械粉碎法.机械粉碎法能耗高,费用大,且豆渣膳食纤维抵抗变形和吸收冲击能的能力大,即使通过传统的粉碎设备(如砂轮磨、胶体磨等)也很难将豆渣颗粒粉碎到足够小.发酵利用微生物对纤维素、半纤维素等的降解,不仅可减少豆渣颗粒大小,而且可以直接把豆渣做成味噌那样的豆渣酱,增加风味和营养.如雅致放射毛霉等可改善豆渣口感,但因口感粗糙仍需要机械粉碎后才能作为食品原料.所以有必要筛选出更加有效降低豆渣渣感,改善口感的菌株.为此,本文以雅致放射毛霉为参照菌株,利用从腐乳、豆酱、豆豉、霉豆渣、酱油渣中分离纯化菌株发酵豆渣,考察了不同菌株发酵豆渣过程中渣感变化,筛选出能发酵豆渣渣感低于雅致放射毛霉发酵豆渣的菌株霉菌M122;通过ITS法和外部形态学观察法对该霉菌M112进行菌株鉴定;虽然1987年美国食品药品监督局把黑曲霉列入食品安全菌株,但基于最近黑曲霉种群产生赭曲霉毒素A的研究时有报导,还测定了霉菌M112发酵10d豆渣中赭曲霉毒素A含量.本研究为综合利用豆渣提供了新方法.1材料和方法1.1含水率新鲜豆渣由北京王致和食品集团有限公司提供,样品取自王致和腐乳厂生产线,含水率为82.13%;发酵菌种详见表1.为判断分离菌株对于发酵后豆渣渣感降低程度,以北京市食品酿造所提供的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans3.118)为筛选参照菌株.共181株菌.1.2仪器、检测方法HZQ-F160型恒温振荡培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司);YXQ-LS-50型立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);LTI-601SD型低温恒温培养箱(日本东京理化器械株式会社);S-3400N型扫描显微镜(日本日立公司);SZ×12+PM10AK型数码显微镜(奥林巴斯(日本)有限公司);TS5BS4型高速匀质机(IKAlabortechnik,Germangy);TCL-16C型台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);510M-01型多参数测定仪(Thermo.Scientifico.Co.Ltd.USA);050-801TGradient96型PCR仪(德国Whatman/Biometra公司);ABI3730XL型测序仪(美国AppliedBiosystems);LC-10A型高压液相色谱仪(日本岛津公司,配有NCI900荧光检测器);DC12型氮气吹干仪(上海安谱科学仪器有限公司).1.3豆渣发酵试验1.3.1降低豆渣渣感菌株的筛选首先制备菌悬液,将发酵菌株分别在相应斜面培养基上活化,再分别挑取活化好的菌株进行扩培培养,活化和扩培条件见表2.最后向三角瓶加入适量质量分数为0.9%的生理盐水,振荡后用无菌纱布过滤,将滤液收集到三角瓶中并用质量分数为0.9%的生理盐水适当稀释,用血球计数板计数,制成2×107～5×107个/mL孢子悬浮液备用.豆渣发酵试验方法:分别称取130g新鲜豆渣于1000mL的三角瓶中,6层纱布封口,在121℃高压灭菌锅内蒸煮20min,冷却至室温后,分别加入质量分数为1%菌悬液,以加入质量分数为1%无菌水的豆渣作为对照(未发酵豆渣),混匀后按不同菌种在设定的温度、湿度条件下置于恒温恒湿培养箱发酵,具体为:霉菌和酵母菌发酵温度为28℃、相对湿度为95%;细菌发酵温度为37℃,相对湿度为95%.发酵时间10d,每隔24h取样1次,依次得到不同菌株发酵豆渣和未发酵豆渣样品.然后对未发酵豆渣样品(0d)和不同菌株发酵豆渣发酵过程中豆渣渣感变化进行打分,并对发酵10d时豆渣风味、色泽进行描述.1.3.2霉菌M122的ITS法鉴定对降低豆渣渣感效果最好菌株霉菌M122进行ITS法鉴定.1.3.3霉菌M122的形态学观察对霉菌M122进行菌落形态特征观察、菌体特征及孢子结构观察.1.3.4赭曲霉毒素A测定对霉菌M122发酵10d的豆渣样品,进行赭曲霉毒素A含量的测定.1.4pcr扩增及序列分析1.4.1降低豆渣渣感菌株的筛选方法分别取豆渣样品10g放于盘中,并随机编号,选20名(男女各半,年龄20～28岁)本研究室经过培训的评价人员独立完成感官品评,分别在感官品评室内对编号样品的渣感依据打分标准打分,并记录样品的风味.渣感具体评分标准为:强(0～20),较强(21～40),中(41～60),较弱(61～80),弱(81～100).1.4.2霉菌M112的ITS法菌株鉴定DNA的提取方法:参照Wang等的方法.PCR扩增:根据真菌整个ITS区设计通用引物:ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG,ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC,以霉菌的DNA基因组为模板,扩增全全长序列的ITS.PCR在50μL的混合液中进行,混合液中含有2.3μL基因组DNA,5μLPCR缓冲液,1μLdNTP(1mmol/L),2μL引物(1.0×10-11mol/μL),0.7μLTaq聚合酶(2U/μL)和37μL超纯无菌水.PCR条件:95℃、1min,95℃、30s55℃、30s,72℃、40s,30个循环;最后72℃延伸10min.DNA序列测定、序列比对:PCR的扩增产物通过聚丙稀酰胺凝胶电泳后,由上海Genecore生物技术有限公司进行测序.然后将DNA序列在GenBank数据库中进行了比对分析.1.4.3霉菌M122的菌株形态学鉴定菌落特征观察:采用三点法,将筛选出的待测菌株点种在察氏培养基上,置于28℃条件下暗培养,并开始观察其菌丝生长速度、色泽变化和孢子颜色等.菌体特征及出孢子结构观察:取载玻片加乳酸-苯酚液1滴,用接种针钩取一小块霉菌培养物,置于乳酸-苯酚液中,用2支分离针将培养物撕成小块,加盖玻片.用光学显微镜观察菌丝和产孢结构;选取培养物2.5%戊二醛固定,然后依次分别用体积分数为60%、70%、80%、90%、95%、99.5%的乙醇溶液梯度脱水、真空喷金等处理后在扫描电子显微镜下观察霉菌的菌丝和孢子的形态特征,孢子的排列.1.4.4赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)测定对鉴定菌株发酵10d的豆渣样品进行赫曲霉毒素A含量的测定,方法参考GB/T23501—2009.1.5处理数据试验重复3次,数据用平均值表示.不同处理之间用SPSS16.0软件采用单因素方差分析进行统计分析,显著性水平为0.05.2结果与分析2.1不同菌种对豆渣渣感的影响利用不同菌株发酵豆渣(由于菌株较多,未能全部列出),其发酵过程中的渣感变化如图1所示.由图1可知,未发酵豆渣渣感强,而经过不同菌株发酵后的豆渣,渣感在整个发酵过程中逐渐减弱其中霉菌前5d发酵豆渣感减少速度较快,其中,霉菌M112发酵豆渣在5d时,渣感强度由强降至弱渣感程度;雅致放射毛霉发酵豆渣在5d时,渣感强度由强降低到中等渣感程度.这说明发酵可以降低豆渣渣感,发酵前5d发酵豆渣感减少速度快,后期趋于稳定,霉菌M112发酵豆渣改善渣感的效果好于雅致放射毛霉发酵豆渣.由图1还可以看出,霉菌、酵母菌和细菌发酵豆渣,其渣感降低程度不同.酵母菌和细菌发酵对于豆渣渣感改善程度较小,发酵10d时,豆渣仍有强渣感;霉菌发酵豆渣好于酵母菌和细菌;不同霉菌发酵豆渣,渣感降低也有显著性差异,霉菌M35、霉菌M36发酵10d时,渣感仍较强,而霉菌M112和雅致放射毛霉发酵豆渣10d时,渣感分别降到弱和极弱的程度.霉菌M112发酵豆渣,其渣感降低的程度和速度均好于雅致放射毛霉.这可能与发酵后豆渣粒径变小有关.有文献报导,雅致放射毛霉发酵可使豆渣口感细腻,酿酒酵母发酵也能改善豆渣适口性.从图1可看出,用本试验筛选出的霉菌M112发酵豆渣比雅致放射毛霉、酵母菌发酵豆渣的渣感降低到极弱的程度,口感更加细腻.雅致放射毛霉制作豆渣酱仍需要机械粉碎后,才能做出消费者口感能接受的产品霉菌M122不用机械粉碎即能达到此效果.本文对霉菌、细菌、酵母菌改善豆渣渣感的能力做了系统研究,也为以后降低豆渣渣感应从霉菌中筛选目标菌株指明了方向.对M122发酵10d豆渣和未发酵豆渣的风味进行记录,未发酵豆渣色泽均为乳白色,固体,有豆香M122发酵10d豆渣呈黑色,酱状流体,略有发酵香气.鉴于霉菌M112发酵豆渣渣感极弱,口感改善效果最佳,又有发酵香气的缘故,可作为豆渣发酵的良好菌株,有必要对其进行鉴定.2.2抗混合型真菌的构建霉菌M112测序结果如下:TTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGCGGGTCCTTTGGGCCCAACCTCCCATCCGTGTCTATTATACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTTTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTTTTCCAGGTGACCTCGATCGAGCGG待鉴定菌株的ITS序列通过在GenBank中进行比对,结果为黑曲霉(AspergillusnigerM112),属于曲霉属(Aspergillus)、环绕亚属(Subgen.Circumdati)、黑色组(Seet.Nigri)真菌(同源性大于99%).2.3加味剂霉菌M112在28℃察氏培养基上菌落形态和菌丝、孢子囊、孢子形态见图2.由图2可知,该菌株在察氏培养基上生长极为迅速;菌丝初为白色,后来变为黑色;菌落平坦,质地呈絮状,松散,较厚;顶部形成球形顶囊,其上全面覆盖一层梗基和一层小梗,小梗上长有成串褐黑色的球状直径2.5~4.0μm.顶囊大球形,分生孢子量大,呈黑色颗粒状.分生孢子头呈明显球状,直径700~800μm褐黑色,具有典型的黑曲霉的形态特征,这也与ITS法鉴定结果相一致.黑曲霉因有产生纤维素酶和果胶酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、半纤维素酶酶等多种酶的能力而被广泛应用于食品行业,这也是黑曲霉能有效降低发酵豆渣渣感、改善豆渣口感的原因.黑曲霉已应用于酱油和豆酱的生产中,但黑曲霉发酵豆渣生产豆渣酱还未见报道.2.4治疗前后用黑曲霉毒素a检测对黑曲霉发酵10d豆渣的赭曲霉毒素A含量进行了测定,其赭曲霉毒素A含量为未检出,国际上谷物及其产品中的OTA限量范围在3~5μg/kg,这说明黑曲霉在发酵豆渣中没有产生赭曲霉毒素A为食品安全菌株.3最佳发酵10d豆渣的确定本研究结果表明:用不同菌株发酵豆渣后,发酵豆渣渣感均比未发酵豆渣渣感降低,口感改善;霉菌发酵豆渣渣感降低程度大于细菌、酵母菌发酵豆渣.从酱油渣中选出