大豆蛋白中蛋白酶的分离纯化研究

大豆蛋白中蛋白酶的分离纯化研究

毛霉菌是腐败发酵的主要细菌之一。它在腐殖生产中的主要作用是分泌细胞膜和转化豆腐胚胎中的大豆蛋白。已有的研究发现,腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽的形式存在,具有相当高的水解程度,并且已经从中分离出多种具有生理活性的多肽;而对众多腐乳产品的感官分析也表明,腐乳产品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上两点来看,毛霉蛋白酶在解决植物蛋白(尤其是大豆蛋白)水解方面存在的技术难题,如水解率低、水解产物具有强烈的苦味等具有很大的潜力。与其它真菌(如米曲霉、青霉、红曲霉等)相类似,毛霉由于长期在高蛋白的培养基上生长驯化,因此,它具有合成及分泌多种胞外蛋白酶的能力,而且其胞外蛋白酶系对于大豆蛋白具有很好的适应性,显示出相当高的水解效率。然而,对毛霉胞外蛋白酶系的深入研究却一直以来为国内外学者所忽视,仅有极少量的报道初步探讨了毛霉胞外蛋白酶的构成,以及粗酶液对大豆蛋白的水解效果,几乎没有报道深入到该蛋白酶系的组分构成以及各组分的催化特性。为了较全面的了解毛霉胞外蛋白酶系的构成,本研究深入探讨了毛霉胞外蛋白酶系的组分构成,各蛋白酶组分的催化特性以及对大豆蛋白的水解特性以期为毛霉胞外蛋白酶的应用提供借鉴。1材料和方法1.1arose、cm-sepharoe、phenyl-没有5b的聚合物雅致放射毛霉AS3.2778:实验室保藏菌种。DEAE-Sepharose、CM-Sepharose、Phenyl-Sepharose、Sepharose6B:Pharmacia公司;大豆分离蛋白(蛋白含量87.35%):哈尔滨高科大豆食品有限公司。1.2测试方法1.2.1福林酚与甘氨酸的反应采用Folin酚法:1.5mL离心管中加入0.3mL适当稀释的酶液及0.3mL1.5%酪蛋白(溶于0.02mol/L,pH9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液),40℃反应l0min,再加0.6mL0.4mo1/L的三氯乙酸终止反应,静置15min后14000g离心10min,取上清液0.6mL,加入3mL0.4mol/L的碳酸钠溶液及0.6mL福林酚试剂,于40℃显色20min,于680nm测其吸光值,根据标准曲线计算酶活单位。酶活定义:试验条件下,每分钟水解酪蛋白释放1μg当量酪氨酸所需的酶量定义为1个活力单位。1.2.2聚丙醇稀释橡胶电泳利用SDS检测纯化后的蛋白酶纯度,采用14%分离胶,5%浓缩胶。1.2.3游离氨基的测定采用甲醛滴定法:取5mL水解样品,加入60mL蒸馏水,用0.1000mol/LNaOH调节到pH8.20,加入20mL己中和的甲醛,然后用0.1000mo1/LNaOH标准溶液滴定到pH9.20,记录消耗NaOH的体积V1。用蒸馏水代替样品,操作方法相同,测得空白体积V0。样品中游离氨基的量/mmol/L=1000×0.1×(V1-V0)/5.0样品水解度DH=[1000×0.l×(V1-V0)/5.00/C-0.33]/7.8×100%式中:C为样品中蛋白浓度/g/L;0.33为大豆蛋白中游离氨基浓度/mmol/g;7.8为每克大豆蛋白的肽键当量数/mmol/g。1.2.4发酵培养基的制备称取8g干麸皮加入到250mL的三角瓶中,按干麸皮与水1∶0.9的比例加入自来水并混匀配制成发酵培养基(其中添加少量的辅助营养物质),灭菌后接种一环经活化的斜面孢子,置于24℃培养48h。取出发酵好的麸曲,捣散后于40℃烘干,即得到了干麸曲。1.2.5粗酶液的提取称取一定量的干麸曲加入10倍质量的0.3mol/L氯化钠溶液,混匀后于40℃水浴中抽提1.5h,纱布过滤后在7000g,4℃离心10min,取上清即得到了粗酶液。1.2.6表达碱性蛋白酶硫酸铵盐析(收集40%～85%的沉淀),用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl缓冲液溶解→DEAE-Sepharose阴离子交换→CM-Sepharose阳离子交换→Phenyl-Sepharose疏水层析→Sepharose6B凝胶层析→纯化的碱性蛋白酶组分Pb1。1.2.7phenyl-phharae疏水层析硫酸铵盐析(收集40%～85%的沉淀),用0.05mol/L,pH5.0醋酸缓冲液溶解→CM-Sepharose阳离子交换(得到两个不同的活性组分)→两组分分别进行Phenyl-Sepharose疏水层析→纯化出两个酸性蛋白酶组分Pal和Pa2。1.2.8毛霉酶各成分的机械特性参考文献,主要考察了温度、pH及抑制剂对毛霉蛋白酶活性的影响;温度和pH对毛霉蛋白酶稳定性的影响。1.2.9活性物质的水解自然pH条件下的水解试验:用蒸馏水配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),并用NaOH溶液调节到pH9.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pb1,然后置于50℃水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。固定pH条件下的水解试验:用0.1mol/LpH9.5NaHCO3-Na2CO3缓冲液配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶,然后置于50℃水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。1.2.1大豆分离蛋白的活性测定自然pH条件下的水解试验:用蒸馏水配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),并调节到pH6.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pa1或Pa2,然后置于50℃水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。固定pH条件下的水解试验:用0.1mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pa1或Pa2,然后置于50℃水浴条件下酶解,测定大豆蛋白水解度的变化。1.2.1大豆蛋白的水解工艺一:配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),调节到pH6.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g分别加入蛋白酶Pb1及Pa1,然后置于50℃水浴条件下酶解5h,测定大豆蛋白水解度的变化。工艺二:配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),用NaOH溶液调节到pH9.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pb1,然后置于50℃水浴条件下酶解2.5h。用稀酸缓慢调节到pH6.5左右,按酶与底物比1000u/g加入酸性蛋白酶Pa1,继续水解到2.5h,测定全过程大豆蛋白水解度的变化。工艺三:配制浓度为5%的大豆分离蛋白(SPI),用NaOH溶液调节其pH到9.5,然后在沸水浴中热处理15min。冷却后按酶与底物比1000u/g加入蛋白酶Pb1,然后置于50℃水浴条件下酶解2.5h(通过连续滴加稀NaOH的方法控制反应体系的pH)。用稀酸缓慢调节到pH6.5左右,按酶与底物比1000u/g加入酸性蛋白酶Pa1,继续水解到2.5h,测定全过程大豆蛋白水解度的变化。2结果与分析2.1pa2的表达如图1所示,纯化出的三种毛霉蛋白酶组分均已达到电泳纯。毛霉酸性蛋白酶(Pa1和Pa2)是该菌种的主要胞外分泌蛋白,其含量远高于碱性蛋白酶(Pb1)组分。电泳显示这三种蛋白酶的分子质量非常接近,其中碱性蛋白酶的相对分子质量为32000,两种酸性蛋白酶Pa1和Pa2的相对分子质量分别为35000和34000。2.2ph对酸性蛋白酶表达的影响如表1所示,纯化出的蛋白酶Pb1组分是一碱性蛋白酶,该蛋白酶在pH9.5、60℃的条件下有最大催化活性,在pH6.0～10.0、低于40℃的条件下有很好的稳定性。与绝大多数碱性蛋白酶相似,PMSF可以完全抑制该蛋白酶的活性,显示Pb1属于丝氨酸蛋白酶家族。Pa1和Pa2均是酸性蛋白酶,在50℃有最大催化活性,其最适作用pH分别在5.5和4.5,与报道的青霉P-1007酸性蛋白酶的最适作用pH相同,而普遍高于已报道的其他真菌类酸性蛋白酶,如黑曲霉酸性蛋白酶(pH3.5),宇佐美曲霉酸性蛋白酶(pH2.5),米曲霉酸性蛋白酶(pH4.0)。与以上报道的真菌酸性蛋白酶相似,Pepstatin可以完全抑制Pa1和Pa2的活性,说明Pa1与Pa2属于天冬氨酸蛋白酶家族。2.3spi水解度随时间的变化探讨了碱性蛋白酶对大豆分离蛋白(SPI)的水解效果,结果如图2所示。在两种不同模式下(自然pH和固定pH)进行的水解试验,SPI的最终水解度不同:固定pH条件下SPI的最终水解度高于自然pH条件。不过,两种情况下SPI的水解度具有非常相似的变化趋势:在水解的初期(1h内)SPI的水解度随时间迅速增加,随后SPI的水解速度减缓并趋于终止。这主要有两个方面的原因:(1)随着SPI的水解,形成了大量形式多样的小肽,而某些小肽对蛋白酶具有竞争抑制作用,这在一定程度上削弱了反应体系的酶活。这是固定pH条件下SPI水解度趋于稳定的主要原因;(2)在自然pH条件下进行的水解试验,随着水解的进行反应体系的pH会迅速下降,并趋于稳定(如图3所示)。而pH的降低将直接会导致碱性蛋白酶活性的降低。也正是由于这一原因从而导致了自然pH条件下SPI的最终水解度低于固定pH条件下的水解。从Pb1对SPI的水解效果来看,在SPI浓度5%,酶与底物比1000u/g的条件下,50℃水解5h,SPI的水解度可以达到14.5%左右,这一结果高于已有的文献报道(采用同类检测方法)。结果表明,毛霉碱性蛋白酶对大豆蛋白确实有相对较强的水解能力。2.4酶切位点不同探讨了毛霉酸性蛋白酶Pa1和Pa2对SPI的水解效果,结果见图4和图5,在试验条件下Pa1与Pa2对SPI具有相近的水解效果,而两者的水解效率均比Pb1低。这可能与蛋白酶的催化作用位点(即肽键选择性)有关。一般而言,酸性蛋白酶的肽键选择性相对较窄,在底物蛋白上的酶切位点较少;而碱性蛋白酶的肽键选择性相对较宽泛,在蛋白底物上具有较多的酶切位点。另一个重要原因可能与底物蛋白的分散性有关,特别是对于酸性蛋白酶,由于试验条件的pH与SPI的等电点(pH4.5左右)相近,SPI在酸性环境中非常难溶解,在这种情况下酶与底物难以接触,从而导致水解效率较低。也正是由于这一原因,在酸性蛋白酶的水解试验中采用了pH6.5的试验条件。此外还发现,在两种模式下(自然pH和固定pH)进行的水解试验,其最终的结果基本上没有什么大的区别,这可能是由于在偏酸性的条件下进行水解时,水解产生的小肽基本上不会影响到体系的pH变化,即不会出现pH变化影响蛋白酶活性的情况,因此两种模式下的水解效果基本相同。2.5酶解过程对spi水解效果的影响众多的研究显示,多种蛋白酶的复合作用效果往往优于单一蛋白酶。其原因主要是由于不同类型蛋白酶的底物专一性通常存在一定的互补性,因此它们在一定程度上可以互相解除水解过程中形成的小肽对蛋白酶的竞争抑制作用。为了探讨这一作用,我们考察了毛霉酸性蛋白酶与碱性蛋白酶在不同方式下对SPI的复合水解效果,结果如图6所示。比较三种不同水解工艺可以看出,复合酶解工艺一的水解效果最差,SPI的最终水解度仅达到8.5%。其原因主要来自两个方面:(1)碱性蛋白酶在偏酸性条件下的酶活较低,没能充分发挥其水解能力;(2)当起始条件为偏酸性时,SPI难以溶解分散,影响了底物与酶的充分结合。而工艺三则能很好的弥补以上两个缺陷:首先,起始的碱性条件使碱性蛋白酶充分发挥作用;其次,通过碱性蛋白酶的预水解,改善了SPI在偏酸性条件下的溶解性,有利于酸性蛋白酶与底物的充分结合,提高的酸性蛋白酶的水解效率。因此,复合酶解工艺三的水解效果最好,SPI最终水解度可以达到21%左右。另外,综合分析以上试验结果可以看出,来源于同一毛霉的酸性蛋白酶与碱性蛋白酶确实具有一定的协同效果,两种蛋白酶的复合作用效果略优于单一蛋白酶作用效果之和。3spi水解酶活性与其他真菌相似,毛霉胞外蛋白水解系统也是由多种不同的蛋白酶所构成。结合多种层析方法从毛霉发酵麸曲中分离纯化出三种不同的蛋白酶组分,其中包括一种碱性蛋白酶和两种酸性