蛋白多肽类药物体内动力学的生物样品分析方法

蛋白多肽类药物体内动力学的生物样品分析方法

随着生物技术的繁荣和发展以及互补理论的进步，越来越多的蛋白质和多媒体药物已经开发，用于疾病的诊断和治疗。目前常见的蛋白多肽类药物有干扰素类、白细胞介素、生长因子类、单克隆抗体、细胞因子、抗凝血剂和血栓溶解剂等。蛋白多肽类药物的生理活性强、疗效高,在维持机体正常功能中发挥着重要的作用,目前已成为国际药学界研究的热门课题。体内动力学过程的研究是任何药物研发过程中必不可少的重要环节,由于蛋白多肽类药物具有相对分子质量大、不易透过生物膜、易酶解、有多种降解代谢途径等特点,使其体内动力学研究有着重要意义。蛋白多肽类药物的用药剂量小、血药浓度低、半衰期短,加之易受内源性物质干扰,对其体内动力学研究的分析方法提出了很高的要求。因此选择灵敏度高、专属性强和在操作过程中样品损失少的药物分析方法至关重要。目前,用于蛋白多肽类药物体内动力学研究的常规分析方法主要有免疫学分析法、同位素标记示踪法、生物检定法和理化分析技术4种。这4种分析方法都有各自的缺点,常常会影响到对药物体内动力学参数的解释。在利用一种以上的分析方法来分析蛋白多肽类药物体内动力学过程时,也会出现不同结果,并且很难确定哪种分析方法更适合。除同位素示踪法可以进行在位检测药物的体内分布外,其余方法都需进行烦琐的样品获得和处理步骤,却不能得到药物在体内的实时过程。本文简介目前这4种常规分析方法在蛋白多肽类药物体内动力学上的应用,并对一种无损在位实时检测技术——荧光标记近红外检测技术在蛋白多肽类药物体内动力学无损实时在位分析上的应用前景和尚待解决的问题进行介绍。1传统分析方法对蛋白质丙酸酯中毒的动力学研究的应用1.1elisa法检测基因的表达免疫学分析法(immunoassay)是一种基于抗体-抗原反应的分析方法,反应信号产生于连接到抗原或抗体上的标记物。由于蛋白多肽类药物是生物大分子,具有免疫原性,因此免疫学分析法是其药物动力学研究所选择的常用定量分析法,具有快速、灵敏和经济的特点。免疫学分析法主要有三大类:酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和免疫放射测定法(IRMA)。ELISA具有灵敏度高和非放射性的优点,可以批量测定。1971年瑞典学者Engvall和Perlman通过包被抗原到塑料表面发展ELISA来分析特异性的抗体。这种方法后来被改为两点免疫测定系统,就是将第一抗体吸附到塑料表面形成固相抗体,加入含相应抗原的待测样本,抗原与固相抗体结合成复合物,再加入特异性酶标第二抗体,后者与已形成的抗原-抗体复合物结合,加入酶的相应底物,根据酶催化底物显示的颜色深浅对待测物进行定性或定量分析。通过第二个酶标记抗体的加入,增加了其检测的灵敏度。如黄青山等自行建立的测定重组溶葡球菌酶的ELISA法检测限达到0.98μg/L。Nirmala等利用抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(HRP)扩增系统作为ELISA法的检测指标来测定大鼠血浆中的粒细胞集落刺激因子,使其最低定量限能达到4.88ng/L。ELISA法的高灵敏度使其在蛋白多肽类药物的体内动力学研究中得到广泛应用。Statler等利用ELISA法研究了腹腔注射和皮下注射重组人红细胞生成素(rEpo)在大鼠血浆和脑组织中的动力学,结果表明rEpo通过循环系统透过血脑屏障的能力有剂量依赖性。Zhou等用验证过的ELISA法研究了一个人类抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体——golimumab在类风湿关节炎患者中的体内动力学并进行了安全性评价。Quesada等采用ELISA法研究了免疫球蛋白抗蛇毒素在正常家兔和肌内注射蝰蛇毒液模拟中毒家兔体内的动力学过程,结果显示抗蛇毒素在对照家兔和中毒家兔中的体内动力学参数无明显差异。Venkatesan等用ELISA法分析了促红细胞生成素黏膜粘着剂片剂在大鼠和狗体内的动力学研究,体内动力学参数显示黏膜粘着剂片剂有望成为蛋白类药物口服给药系统。RIA和IRMA都是利用放射性核素来进行定量的测定方法,其测定结果的优劣取决于抗体的选择。由于这两种测定方法都用到放射性核素,产生了对人体有伤害的辐射而使其应用受到限制,逐渐被别的方法所取代。免疫学分析法虽广泛用于蛋白多肽类药物的定量分析,但也存在一些缺点:(1)缺少特异性,不能分辨出蛋白多肽类药物的活性和非活性形式;(2)许多内源性和外源性物质如结合蛋白、抗体和代谢物会干扰测定;(3)给予蛋白类药物后引起的抗体形成能导致免疫学分析法所测得的蛋白多肽类药物的浓度的降低;(4)免疫分析法有基质特异性,如一种适合分析血浆中蛋白类药物的方法却不适合测定尿样中的相同蛋白多肽类药物。1.2检测放射性碘检测方法同位素标记示踪法(isotopelabeltraceassay)是在被测分子上标记放射性同位素来区分内源性物质与外源性药物,再借助液闪仪等放射性探测设备读取生物样品的放射性计数,以此推断标记药物的血药浓度的分析方法。该法灵敏度较高,并能同时了解标记药物在生物体内的吸收、分布、排泄,因此在生物大分子药物的组织分布分析上有突出优势。Plech等用同位素125I标记的-白细胞焦激肽研究其在大鼠脑部和内脏器官中的分布,发现其在肾上腺、下丘脑和大脑海马部位有很高的积聚。标记法有体内掺入法和体外化学连接法两种。体内掺入法是将标记3H、14C或35S等同位素的氨基酸加入到生长细胞或合成体系中,从而获得同位素的蛋白多肽分子,但因操作复杂而很少使用。体外化学连接法常用的同位素是125I,其因比放射性高,制备简单,半衰期短而被认为是较理想的同位素标记元素,应用广泛。125I标记主要有氯胺T、Iodogen直接标记法和Bolton-Hunter试剂间接标记法。Iodogen法适于标记含有酪氨酸或赖氨酸的蛋白,标记效率高、反应温和;对于不含酪氨酸的蛋白可通过引入酪氨酸甲酯后再进行标记,但这种方法得到的标记物存在体内迅速脱碘并使放射性碘被甲状腺所摄取的问题。Song等利用Bolton-Hunter试剂标记血管抑素(angiostatin,AS)得到125I-BH-AS,并与常规的碘标记方法得到的125I-AS进行体内稳定性比较,在小鼠中进行的体内分布研究显示,125I-BH-AS在小鼠体内比125I-AS更具明显的稳定性,并且改善了AS在体内的动力学特性。同位素示踪法最大的应用瓶颈是由于蛋白多肽类药物进入体内会被降解代谢,降解生成的标记氨基酸可再重新合成蛋白质,或与其他蛋白质结合,所以总的放射性强度不能代表生物大分子药物的体内过程。基于这个缺点,同位素标记示踪法常与其他分离手段,如十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS)、高效液相色谱法(HPLC)联合进行。SDS法根据生物大分子药物的分子质量的大小选择不同浓度的凝胶电泳,借助于控制电源等条件使原药与其降解代谢产物分离,然后通过切取相应凝胶条直接进行放射性计数或放射自显影方法分析电泳放射性图谱。该法设备简单,具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的优点,是一种较好的方法。同位素标记示踪法与HPLC法结合则以其高度的特异性等特点而成为技术最成熟、应用最广泛的体内药物分析手段,两法结合可增强前者的方法特异性。反相HPLC(RP-HPLC)、排阻HPLC(SE-HPLC)、离子交换HPLC(IE-HPLC)分别根据保留时间与蛋白多肽的疏水-亲水性、相对分子质量大小、解离程度等特征分离样品中待测物质,可同时测定原药和降解产物,其中排阻HPLC也可得到有关结合物的信息,常采用梯度洗脱或阶梯洗脱从而获得较好的分离效果。Visich等利用排阻HPLC法分离定量125I标记重组人凝血酶-内源性抑制子复合物、125I标记重组人凝血酶和游离的125I,结果显示不管是经过静脉给药还是皮下给药,重组人凝血酶都会很快结合到内源性抑制子上,并在肝部积聚后被清除。同位素标记示踪法虽然是蛋白多肽类药物体内动力学研究常用的分析方法,但其缺点也是显而易见的:首先,其不能进行人体药物动力学研究,在动物实验中对实验人员也常产生辐射伤害;其次,随着方法的复杂化,灵敏度、重现性和回收率受到影响,动物实验前需预先进行药物的同位素标记,试验操作相对复杂;再次,同位素标记后可能会引起药物的生物活性及其在生物体内的动力学行为发生变化。如Sohoel等用125I标记门冬胰岛素和未标记的门冬胰岛素进行皮下注射吸收速率的比较,通过测定血浆样品中的门冬胰岛素含量显示碘标记明显影响了门冬胰岛素的皮下吸收。1.3体外动力学研究生物检定法(bioassay)的基本原理是利用体内模型、体外组织、细胞或酶等体系测定蛋白多肽类药物的某种特异反应,通过剂量(或浓度)-效应曲线对目标蛋白多肽类药物定量分析(绝对量或比活性单位)。该法一般分体内分析和体外分析两类,体内分析法一般通过分析药物的底物或产物而间接反映药物的药效,不能得到真正的药物在体内的动力学过程,所以蛋白多肽类药物体内动力学的分析一般采用体外分析法。体外分析法通常采用细胞体外培养技术,以细胞的增殖、分化或细胞毒性为基础,以细胞数目的增减为量效指标,如Wei等利用两种新的治疗用重组促红细胞生成蛋白(EP1和EP2)刺激SD大鼠红细胞生成的特性以评价其体内动力学。也可利用体外酶体系进行生物检定法分析,如Han等利用水蛭素对抗凝血酶活性的影响间接分析了N-Ile1-Thr2-63-去硫重组水蛭素(rH)在家兔的体内动力学,实验结果表明rH在家兔体内迅速消除,分布局限于细胞间隙,在皮下注射点吸收迅速,主要通过肾排泄。生物检定法也有活性代谢产物、生物基质和血清中抑制因子等内源性物质对分析产生干扰的缺点,使方法的专属性降低。1.4膜-质谱分析技术的应用理化分析技术(physicochemicalanalysistechniques)主要包括色谱法、毛细管电泳、质谱法以及它们之间的联用技术。色谱法对混合物有良好的分离鉴定能力,这种方法因具有高度的特异性,能精确定量并能同时测定多种成分而在药物体内动力学分析上占有重要的地位。色谱法中最常用的是HPLC法,包括RP-HPLC、SE-HPLC和IE-HPLC。HPLC法具有分离效率高、分离速度快等优点,但对于多数蛋白多肽类药物而言,由于尚未建立结构与功能之间确切的对应关系而使HPLC法不能得到广泛的应用,多需与其他方法联用才能满足分析的要求,如前面提到的同位素标记、免疫方法,以及后面描述的液质在线联用。目前采用HPLC法直接进行药物动力学分析的蛋白多肽类药物只有胰岛素、生长激素等个别品种。毛细管电泳(CE)具有分辨率高、分析时间短、样品用量少及操作简单等诸多优点。蛋白多肽类药物具有扩散系数小的特点,而毛细管的柱效与样品分子的扩散系数成反比,这正好适合于此类药物的分析研究。高效毛细管电泳(HPCE)是电泳技术与色谱技术相结合的一种分析技术,以高压电场为驱动力,以类似于色谱柱的毛细管为分离通道,依样品中被测组分之间电泳淌度和分配系数的不同而达到分离目的。HPCE分离效率高、上样量少、分析速度快,是一种灵敏的蛋白多肽类药物的分析方法,但该方法也存在检测灵敏度不足和重现性差等缺点。质谱法(MS)长期以来一直用于小分子化合物的结构分析。直到20世纪80年代末电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)两种“软电离”技术的出现,才使质谱用于分析蛋白多肽类大分子物质成为可能。然而生物样品的处理过程和生物样品中蛋白多肽类药物的含量太低都限制了其应用。将液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、强专属性结合起来的液质联用技术(LC-MS,LC-MS-MS)是近几年发展起来的药物体内动力学研究分析方法。Becher等采用LC/ESI-MS/MS研究了一个含有56个氨基酸的重组蛋白质药物EPI-hNE4在猴体内的药物动力学,定量限达到5μg/L,批间和批内精密度以及准确度良好且无基质效应。这种联用技术能分析生物样品中的痕量组分,灵敏度高,专属性强,分析速度快,能同时获得生物样品中多种成分可靠的定性和定量结果。Yang等用LC-ESI-MS-MS分析了DADLE(H2N-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-COOH)及其两个前体药物,利用内标法增加方法的精密度和准确度,结果DADLE的定量限达到0.5μg/L,两个前体药物分别为2和5μg/L,在定量限至1000μg/L的范围内均呈现良好的线性关系。2荧光标记近红外技术在肿瘤诊断和治疗中的应用近红外技术的原理是近红外光波段(700～900nm)在生物组织中水和血红蛋白的吸收都很少,能穿透深度达几厘米的组织且无任何副作用,同时激发的荧光受生物组织本底的影响较少,所以能在深层组织产生信号。利用近红外光谱的组织穿透力,通过蛋白多肽类药物的近红外荧光染料标记,再利用荧光技术的高灵敏度、特异性来定量分析药物动力学特征,可实现体内药物的在位实时监测。如Ramjiawan等用近红外染料Cy5.5.18标记抗肿瘤抗体片段NovoMab-G2-scFv,对后者在裸鼠体内的动力学进行了研究,近红外成像显示了标记复合物的组织分布,显示标记复合物进入体内后主要分布在肾脏、肝脏和肿瘤组织中,另外,实验得到了抗体片段在肿瘤组织内的动力学参数和在肿瘤组织中的消除半衰期。在研究药物或药物载体在体内的传输机制时,近红外荧光成像技术成为一个有力的监测手段,可研究跟踪药物或药物载体在体内的途径,以确定药物是否成功地传输到作用靶位和器官。该技术可从分子、细胞水平上进行分析,是一种分辨率相当高的活体研究手段,只要药物标记上一定的荧光,这个分子就可以被跟踪进而发现其转运过程。多肽类药物的体内转运和代谢途径的研究适合使用近红外显影技术。如Camphausen等用Cy5.5标记血管内皮抑素研究了它在体内对肿瘤附着的情况,荧光信号显示它能在短时间内锚定肿瘤,42小时后肿瘤区域药物达到最大浓度。还有一些药物可以连接在发射峰位于近红外区的无机量子点上,通过近红外荧光显影对其分布代谢情况进行考察。如Ren等通过11-巯基十一酸(MUA)将顺铂和金纳米粒子结合,分析了这一抗癌药物在体内的传递过程。目前荧光标记近红外技术多应用在肿瘤的诊断领域,应用于蛋白多肽类药物体内动力学过程的研究还只是一个开端。而且,这项技术尚存在许多亟待解决的问题,如荧光染料自身的光漂白现象,标记物质体内的荧光染料脱落,这些都会影响到定量、半定量分析的准确性。蛋白多肽类物质由于标记了荧光物质而导致其在体内的处置发生变化。荧光标记蛋白多肽类药物进入体内后分布在不同的组织,由于这些组织深度不同、光学性质也有差异,导致相同组织或不同组织相同浓度产生的表面荧光强度常常差别很大,给在位定量或半定量分析带来困难。Patwardhan等设计了一种快速扫描荧光成像近红外装置,其利用多点矩阵扫描光学成像后,通过建立数学模型计算得出在不同深度的组织中荧光强度的大小,能够实现定量分析。但数学模型的建立过于烦琐且可信度也不高。荧光标记近红外技术应用到蛋白多肽类药物体内动力学的研究虽然面临着很多困难,但其无损的实时的在位检测优点使这类药物的研发有着诱人的前景。随着水溶性更好、荧光效率更高的近红外染料的不断开发和近红外检测仪器的不断完善,应用荧光标记近红外技术建立蛋白多肽类药物无损实时在位的检测方法平台一定能够实现并加速此类药物的研究步伐。3蛋白多肽类药物动