海兔毒素10抗肿瘤作用机制的研究进展

海兔毒素10抗肿瘤作用机制的研究进展

0生物活性化合物现在，肿瘤是威胁人类健康的最大杀手之一。我国癌症每年新发病例约为200万,因癌症死亡人数高达140多万,故肿瘤的治疗药物一直是基础医学和临床研究的热点课题,其中新药的开发利用是重中之重。海洋生物资源丰富,异于陆地生物的生存环境,而且其肽类次级代谢产物结构特别,提供了不同于陆地生物的活性产物。经过多年研究,现已从多种海洋生物中,分离出了一系列的高活性抗肿瘤多肽,其多肽结构与陆生动植物肽类(多为糖肽)有很大区别,含有丰富的羟基酸、噻酚、D-型氨基酸与α-氨基酸,部分还含有烯键与炔键,这些组分均提高了肽类的生物活性及稳定性。其中由4个氨基酸组成的线性小肽海兔毒素10(dolastatin10,D10)的抗癌活性最为明显。目前D10及其衍生物已进入临床研究阶段。本文就D10的发现、结构特点与作用机制,D10及其衍生物的临床疗效及不良反应等进行综述。1活性化合物的筛选早在上世纪70年代,Pettit等就开始开展对印度洋无壳软体动物截尾海兔(Dolabellaauricularia)中抗肿瘤活性成分的研究,并发现海兔提取物可以延长P388白血病小鼠的寿命。但由于获得的这种活性物质含量太低以及当时技术条件的限制,直到80年代才开始以小鼠白血病P388模型为筛选体系,对印度洋、太平洋等海域的海兔进行了系统的研究。用色谱技术对2吨原料进行近2万次反复分离筛选,Pettit的研究组至今已鉴定出18个含有特殊氨基酸的较短链状肽类化合物,命名为dolastatin1~18。其中抗肿瘤活性最强者为dolastatin10。在体外抗肿瘤筛选中,D10对P388和L1210白血病细胞、非霍奇金淋巴瘤细胞、B16黑色素瘤、小细胞肺癌细胞和人前列腺癌DU-145细胞都有较强的效果。由于取材不易,提取效率较低,Pettit的研究组对D10进行了全合成,这为进一步研究提供了材料。2s10是抗有丝分裂药D10是由4个氨基酸组成的线性缩肽类天然细胞毒性蛋白,见图1,含有9个不对称碳原子,从氨基端开始依次是dolavaline(Dov)、valine、dolaisoleuine(Dil)、dolaproine(Dap)4种氨基酸及特异的可能从苯丙氨酸分离出来的伯胺dolaphenie(Doe)作为羧基端缩合而成,故有研究者称其为5肽产物,相对分子质量为784。D10有一系列同分异构体,其中一些具有生物效应。D10是一种有效的抗有丝分裂药,其抗肿瘤机制主要是通过与β微管蛋白的氨基酸残基结合,影响新的异二聚体的加入,导致二聚体间的界面产生弯曲,累积后导致原来直纤丝弯曲,抑制微管的形成和聚合,并促使其解聚,同时阻碍微管蛋白依赖的GTP水解,阻碍细胞的有丝分裂,使细胞停滞在细胞间期,且对多种癌细胞有诱导凋亡作用,是一类来源于海洋生物的新型细胞生长抑制剂。进一步研究表明,D10可结合到微管蛋白上的根霉素/美登素交换GTP的结合位点,导致细胞阻滞在M期。在与其他抗有丝分裂药物的比较发现,D10对细胞活性的抑制效果IC50=0.5nMol/L,约为长春碱(vinblastine)的40倍,根霉素(rhizoxin)的2倍,拟茎点霉毒素A(phomopsinA)的10000余倍,与美坦辛(maytansine,IC50=0.5nMol/L效果相当。研究还发现D10在细胞内的滞留时间比长春碱长很多。D10通过巯基与微管蛋白结合与拟茎点霉毒素A相似,但与长春碱和美坦辛不同。实验研究表明D10是长春碱类药物的非竞争性抑制剂,当将其与作用于微管的药物长春碱合用时显示协同作用。D10可以抑制弥漫性大细胞淋巴瘤细胞中凋亡信号通路关键蛋白bcl-2和p53蛋白的表达,诱导细胞凋亡。通过研究D10对黑色素瘤细胞染色体形态学、端粒联合、诱导多倍性的影响,发现D10可能通过介导末端着丝粒的丢失,诱导染色体畸变从而抑制恶性黑色素瘤细胞生长。3dolain10及其衍生物的临床应用3.1临床试验结果自1990年以来D10进入多种疾病的Ⅰ期临床试验,在随后的Ⅱ期临床试验中,初步数据结果表明40%的患者出现中度的神经病变,伴随骨髓抑制和静脉炎等副作用。若患者本身有潜在的精神类疾病,副作用更为明显,Kindler等用D10进行治疗28例未接受化疗的癌症患者(12例胰腺癌和16例肝胆管癌,静脉注射给药剂量为400mg/m2。每间隔3周给药1次,每2个周期治疗后进行CT检测。结果显示:27例患者出现临床效应,但不明显。59%的患者表现为嗜中性粒细胞减少(3~4级),18%的患者表现为发热。胰腺癌患者平均寿命约为5个月,经D10治疗的患者有17%可存活1年。肝胆管癌患者的平均寿命为3个月,经D10治疗29%的患者可存活1年。故认为D10对胰腺癌和肝胆管癌无特殊疗效。同年,Perez等对已接受了1~2种化疗的21例转移性乳腺癌患者静脉注射D10,剂量为400mg/m2,每3周一次,结果显示其中有1例患者经过113天治疗后获得部分恢复,4例患者经过87天的治疗,病情稳定,但同时出现了嗜中性粒细胞减少症(3~4级)。在其毒性可以接受的剂量范围内,D10对乳腺癌的疗效不明显,因此不推荐应用于进一步的临床治疗。在D10针对软组织肉瘤的Ⅱ期临床试验中疗效亦不明显。D10在对实体瘤的Ⅱ期临床试验中效果均不理想,并出现明显的副作用,故未单独用于临床治疗,可与其他抗癌药物联合使用。3.2tzt-1087对小鼠肿瘤细胞毒活性和血管毒性的作用由于D10在Ⅱ期临床验证中未获得预期的结果,而且其化学结构复杂,低水溶性难以利用,D10衍生物的研究受到重视,如TZT-1027(auristatinPE)和auristatinPYE在临床显示出显著的治疗效果。TZT-1027是完全合成的D-10衍生物,用苯乙胺取代Doe单位,扩大了抗肿瘤谱。在细胞分裂期通过化学键连接到到微管蛋白上,干扰微管聚合及稳定性,使细胞从G2期到M期的分化停滞,导致细胞凋亡。Watanabe等将TZT-1027与其他抗癌药如紫杉醇、阿霉素和长春新碱分别作用于体内乳腺癌肿瘤模型,结果显示TZT-1027的抗肿瘤活性明显高于其他抗癌药物。此外,TZT-1027也能通过抑制血管生成来破坏肿瘤中的血管杀灭肿瘤细胞。将TZT-1027作用于小鼠肿瘤模型3h后,在肿瘤的血管系统中血液流动受到阻碍,随之发生继发性血管断裂坏死,导致肿瘤细胞因缺氧而死亡。TZT-1027的分子结构见图2,对癌症细胞表现出高效的细胞毒活性。在Ⅰ期临床试验中,Yamamoto等对早期软组织肉瘤患者静脉注射TZT-1027,检测其最大耐受剂量,逐渐从0.3mg/m2增至2.1mg/m2,每周1次,3周为1个周期。结果显示TZT-1027为安全、有效的抗癌药物,血液毒性也在临床控制范围内。Horti等对小细胞肺癌进行的Ⅰ期临床试验中,发现TZT-1027的最大耐受量为4.8mg/m2,每3周注射1次。目前,TZT-1027已进入了Ⅱ期临床试验阶段。AuristatinPYE是以吡啶基团取代D10的Doe单位,作用机制也是通过抑制微管的聚合,使其从G2期到M期分化停滞,导致肿瘤细胞凋亡。2005年以来,Shnyder等对auristatinPYE的细胞毒活性和机制做了深入研究,发现在μmol浓度范围内,auristatinPYE能够显著抑制微管的聚合从而抑制肿瘤生长。为了进一步研究其作用机制,Shnyder等还观察了auristatinPYE对人结肠癌模型体内和体外的效果,将auristatinPYE和D10分别作用于DLD-1和COLO2052种人类结肠癌细胞系,体外给药96h后auristatinPYE对上述2种细胞的IC50分别为4.4nmol/L和1.2nmol/L,而D10均为0.3nmol/L,提示体外实验中auristatinPYE的效果低于D10。但在体内试验中,可以观察到auristatinPYE给药后的裸鼠体内肿瘤体积明显缩小,其机制可能是血管抑制作用。临床前研究的结果促进了进一步的临床试验。3.3半胱氨酸残基偶联随着单抗药物在癌症治疗中的应用,对D10衍生物与抗体的偶联进行了更多的研究,并在抗癌治疗的临床试验中显示出良好的前景。目前,已进入Ⅱ期临床试验的有SGN-35(图3)和CR011-vc-MMAE等,其中对SGN-35的研究较为详细。SGN-35由含有D10衍生物的一甲基-auristatin-谷氨酸(monomethylauristatinE,MMAE)通过二肽交联剂与抗CD30抗体(即cAC10)分子链内还原的半胱氨酸残基偶联,形成cAC10-Val-Cit-MMAE偶联物,针对霍奇金病细胞中的CD30抗原和癌细胞中的LeY抗原。在动物体内实验中,SGN-35的治疗剂量和完全治愈剂量仅为最大耐受剂量的1/200。在对22名霍奇金病患者进行治疗,剂量为1.2mg/kg,45%的患者达到部分缓解,其中23%完全消退,86%的患者治疗后有好转。现已可以确定SGN-35具有最低限度的免疫原性,大多数患者可以接受至少6个月以上的治疗。还有一些D10衍生物及其偶联物正处于Ⅰ期临床试验阶段。如MEDI-547,将一甲基-auristatin-苯丙氨酸(monomethylauristatinF,MMAF)和抗酪氨酸蛋白激酶受体EphA2的单抗1C1通过不裂解的交联剂偶联,又称MEDI-547,可刺激半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7活化。EphA2在乳腺癌、前列腺癌、肺癌及多形性胶质母细胞瘤细胞上过度表达。在体外试验中,MEDI-547能降低子宫内膜癌细胞系中Hec-1A和Ishikawa细胞活力,加速其凋亡。在体内试验中,MEDI-547能诱导EphA2降解,能有效的抑制肿瘤的生长,抑制率达86%~88%,且能降低肿瘤的转移率。在I期临床试验阶段,对具有复发性或难治性实体瘤的成人,每3周1次或每周1次,以21天为1个循环,以静脉注射MEDI-547的最高剂量确定MEDI-547的安全性和耐受性,并可用于治疗恶性肿瘤细胞有EphA2表达的患者。4单克隆抗体偶联使用对临床意