生物活性肽分离纯化的研究进展

生物活性肽分离纯化的研究进展

0生物活性肽的功能活性物质的定义是：对身体的功能和状态有积极影响，并可能暂时影响身体健康的特定蛋白质片段。它是沟通细胞与细胞之间、器官与器官之间的重要化学信使,通过内分泌、旁分泌、神经内分泌以及神经分泌等作用方式,传递各种特异信息,是由机体构成的一系列严密控制系统,从而可调节生长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程。对生物活性肽的研究,甚至涉及人类的意识、行为、学习和记忆等更高层次的生命形态和活动规律,涉及免疫防御、肿瘤病变、延缓衰老、生殖控制和生物钟节律等一系列理论和实际问题,因而具有重要的理论意义和实践意义。生物活性肽以其生理功效明显、来源丰富、安全性高、可被开发为功能食品、医药及化妆品等具有高附加值的生物制品。多肽广泛存在于自然界的动物、植物和微生物等之中,来源丰富,原料组成复杂,它的分离、纯化已成了一个研究热点。近年来有关多肽的分离纯化方法很多,主要有高效液相色谱(HPLC)法、超滤法、高效毛细管电泳(HPCE)法等。本文简要介绍了这些方法的基本原理,综述了近年来多肽分离纯化的研究热点,探讨了其今后的发展趋势。1分离纯度方法的研究1.1高效液相色谱法高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上,引用了气相色谱的理论,流动相以高压输送,色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成,从而使柱效大大高于经典液相色谱,同时柱后连有高灵敏度的检测器,可对流出物进行连续检测。高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。它以分离效果好、速度快、样品容量大、灵敏度高和回收率高的特点,而成为生物活性多肽的主要分离纯化方法。该法应用于生物活性多肽的分离纯化研究中,目前主要应用于酶解工程,基因工程等领域。赵骏等以酪蛋白为原料,采用微生物蛋白酶A水解,其酶解产物为血管紧张素转化酶(ACE)。实验采用DA201-C型大孔树脂脱盐,样品脱盐率达到85%以上,ACE抑制率提高1倍,并用SephadexG-15(层析柱规格1.6×85cmI.D.)对脱盐后产物分离纯化,洗脱液为0.02moL/L醋酸缓冲液,反相高效液相色谱(色谱柱μBondapakC183.9×300mmI.D.和μBondapakC1819×300mmI.D.)在以流动相A梯度洗脱的条件下对产物进一步分离纯化,经纯度分析,最终得到单一纯品,其体外ACE抑制率达到84.4%和79.6%。吴亚丽等利用高效液相色谱法分析降血压肽AHP的最佳工艺条件。实验结果表明:RP-HPLC分离AHP的优化后条件有两个,都可实现完全分离。①ACN浓度12%(v/v),TFA浓度0.03%(v/v),洗脱速度0.8mL/min,保留时间为10.30min。②ACN浓度12%(v/v),TFA浓度0.05%(v/v),洗脱速度1.0mL/min,保留时间为11.41min。高效液相色谱分析条件的优化,有利于AHP的检测和分析,也为该法在活性多肽的分离纯化研究提供了一定的实践经验。HPLC是19世纪60年代末发展起来的新型分离分析技术,它分离效果好、分辨率高、分析速度快,为肽类物质的分离、鉴定和纯化合成等提供了有利手段。近年来,HPLC被证明不仅可进行分析,而且还可以进行克量肽的制备。1.2膜的浓缩效果超滤是一种加压膜分离技术,即在一定的压力下,小分子溶质和溶剂能穿过一定孔径特制的薄膜,大分子溶质滞留,从而使大分子物质得到部分的纯化。超滤自20世纪20年代问世后,已成为一种重要的分离试验技术,广泛用于含有小分子溶质的各种生物大分子的浓缩、分离和纯化。此技术的优点是操作简便,成本低廉,不需增加任何化学试剂。尤其是超滤技术的试验条件温和,不需加热,与蒸发和冰冻干燥相比没有相的变化,而且不易引起温度、pH值的变化,因而可以防止生物活性物质如酶的变性、失活和自溶等。袁国栋等采用超滤技术从ε-聚赖氨酸(ε-PL)粗品溶液中纯化ε-PL,研究了超滤过程中的操作压力、操作温度、超滤液的体积和料液初始浓度等因素对膜通量和粗品溶液中蛋白截留率及ε-PL透过率的影响,并确立了采用聚砜膜去除ε-PL粗品溶液中蛋白工艺的最佳参数,在此条件下,蛋白去除率达到86.2%,ε-PL透过率达到86.7%。刘成梅等采用超滤技术分离罗非鱼鱼皮蛋白酶解液(TSP-I),研究了超滤压力、时间和浓度对膜渗透通量、渗透增量和膜效能的影响。结果表明:超滤处理的压力为28Psi、时间为40min、浓度为5%的操作条件下,膜渗透通量为9.98LHM,渗透增量为2.68g/10min,膜效能为3.41g/m2·min,超滤处理达最佳效果。近年来,超滤技术已经被应用于大豆多肽的分离纯化,大大提高了大豆多肽的品质。但是超滤膜在使用过程中的一个主要问题是由于浓差极化、膜孔堵塞及凝胶层出现等因素的影响,导致膜通量随运行时间的延长而降低,因此正确掌握和执行操作参数对超滤系统的长期、安全、稳定运行以及提高产物得率是极为重要的。目前超滤方法研究工作主要集中在膜材料选取方面。超滤法以其大量制备的优势已发展成为实验室和工业生产上分离分析及制备生物大分子的最有效和常用的方法。1.3cec与氨基酸衍生物的分离HPCE是20世纪60年代末由Hjerten在传统的电泳技术基础上发明的,它利用小的毛细管代替传统的大电泳槽,使电泳效率提高了几十倍。此技术在20世纪80年代得到迅猛地发展,是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。程燕等以咔唑-9-乙基氯甲酸酯(CEOC)作为柱前衍生试剂,在胶束电动色谱模式下对16种二肽进行了分离,研究了用该试剂衍生的二肽物分离的几个关键的条件,在14min内实现了16种CEOC二肽衍生物的分离。EliZahou等采用毛细管电泳技术对蛋白质水解物中的多肽进行分离纯化研究,该法采用异硫氰酸苯酯衍生并在磷酸缓冲液中加入SDS来提高分离度,缩短分离时间,且苯基硫代氮甲酰衍生物的检测在一定范围内有良好的线性关系,线性相关系数为0.9938,迁移时间和峰面积的变化平均在1.1%~2.7%之间。研究表明,对10~600个氨基酸残基的多肽,该方法的灵敏度比HPLC高20倍,而比传统的基于茚三酮的方法则高1000倍。此外,SigridC.等用毛细管电泳对谷氨酰基三肽及它们的降解物和异构体进行了分离。Ye等以强阳离子交换填料为固定相的IE-CEC分离小分子肽。Fu等用亲水离子CEC分离了小分子肽的。作为一种迅猛发展起来的新分离分析技术,HPCE以其高效、快速和低实验消耗等优点,受到了广泛重视,在药物分析、食品安全监测和生命科学等领域发挥着越来越重要的作用。1.4cec分离及其系统结构毛细管电色谱(CEC)是近10年来综合了现代最新分离技术HPLC和毛细管电泳(CE)的优势而发展起来的一种高效、快速的新型微柱分离方法。它有机地结合了HPLC的多选择性和CE的高效性,已越来越多地用于手性物质的研究。毛细管电色谱法(CEC)是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、键合色谱固定相,用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法,它克服了毛细管电泳(CE)对电中性物质难分离的缺点,并且结合了液相色谱固定相和流动相选择性多的优点,是高效液相色谱法和高效毛细管电泳的有机结合。Walhagen等早期用HypersilC8、C18混合模式以及SpherisorbC18/SC柱(0.100×250mm),以乙氰-三乙胺-磷酸(pH值3)为流动相,研究了CEC分离碱性、中性和酸性多肽的选择性和保留行为,其结果与CZE和RP-HPLC的结果完全不同。后来walhagen等又以各种不同的N-烷基硅胶反相吸附剂作为固定相,以及混合模式固定相(同时将强阳离子交换基团和N-烷基键合到硅胶表面),以不同pH值的流动相,考察了激素类的线型或环状的活性肽如:enkephalin、angiotensin、desmopressin、earbetoein和xytocin的保留行为。MingliangYe等应用强阳离子交换填充物做固定相的离子交换毛细管电色谱(IE-CEC)对肽的分离进行了研究。实验中的理论板数达到240000~460000板/m,且连续10次测定,迁移时间的相对标准差小于0.27%,应用IE-CEC可以在3.5min内对10种肽进行快速分离。KaiZhang等则采用加压毛细管电色谱对多肽进行分离。进行连续梯度洗脱,流动相受压力和电渗的共同驱使,在分离复杂样品时比等度压力毛细管电色谱具有更好的效果。CEC作为一种新型的分离分析方法,兼有高效、多选择性、用量少、峰容量大、比HPLC更易与MS联用等优点。近年来CEC分离的研究迅速增多,但国内学者对CEC法分离纯化多肽的研究不是很多且技术不够成熟,有待于科研工作者今后不懈的努力。1.5bmp分离纯化随着科学技术和蛋白质组学的发展,生物制品的分离纯化技术已成为生物技术实现产业化的关键。采取何种方法分离纯化多肽物质要根据分离的多肽物质性质的不同,采用不同的分离手段。当某一种分离纯化方法不能满足人们对样品纯度和制备量的要求时,就应该将几种分离分析方法结合使用。以下为几种联用技术的应用实例。杨超等使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对重组酵母发酵液中一种牛肉风味肽(BMP)进行了分离纯化和稳定性研究。该研究分别运用D301离子交换层析和SephadexG-25凝胶过滤层析对其进行了分离纯化,利用RP-HPLC对目标肽进行分析检测。分离纯化结果显示,SephadexG-25凝胶过滤层析的分离纯化效果优于D301离子交换层析,更适合于分离复杂体系发酵液中的风味肽。刘璇等利用凝胶过滤层析SephadexG-75和强阳离子交换色谱SP-650M相结合,从苦瓜籽中分离纯化出一种活性多肽。该多肽在Tricine-SDS上显示为单一的谱带,分子量约为6.8kDa.在经还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理后的电泳结果表明该多肽不含有分子间的二硫键。此多肽是一种胰蛋白酶抑制剂,同时具有抗植物致病菌活性,是一种具有双功能作用的多肽。目前,多种类型分离纯化技术在生化产品应用中协同发展,技术联用,取长补短,实行多级分离是生物活性多肽分离纯化的发展趋势。可以预见,在不久的将来,会建立一套完整的多肽类物质的分离和提纯技术,并且这一技术会向快速、灵敏及高自动化方向发展,以满足科研及生产的需要。2生物活性多肽的发展趋势随着生命科学的发展,生物制品的分离纯化技术已成为生物技术实现产业化的关键,尤其是对推动我国多肽类保健食品和药品的产业化具有重要意义。目前这方面的研究十分活跃,且不断向纵深方向发展。各种新的分析方法、分离技术以及联用技术将大大推动其研究进展,攻破了许多悬而未决的难题