抗菌肽的抗菌机制及细菌耐药机制

抗菌肽的抗菌机制及细菌耐药机制

抗菌酶是一种由主枝产生的能够抵抗外部病原体感染的小分子醚。它广泛存在于各种生物体中，不仅具有特定的抗凝剂效果，而且还具有肿瘤细胞作用。它与传统抗生素的作用机制不同,故细菌不易对它产生耐药性。目前世界上已知的抗菌肽共有1700余种,并且不断有新发现的抗菌肽被补充到抗菌肽数据库中。1抗菌酶的来源1.1抗菌肽的分离和利用自发现天蚕素以来,至今已从自然生物中成功分离得到上千种抗菌肽,并且分布极其广泛,目前在微生物、植物和动物中均有发现并分离得到具有抗微生物活性的多肽。1.1.1抗菌肽的抗菌性能微生物源抗菌肽包括病毒源和细菌源,最早发现的病毒源抗菌肽是人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)包膜蛋白胞质尾部,与其他慢性病毒的穿膜蛋白的抗菌肽一样,同样具备抗菌活性和细胞毒性。这类抗菌肽的精氨酸含量高,不含有赖氨酸。抗菌肽具备抗菌活性,但细菌同样也能产生抗菌肽保护自身。细菌中已发现的抗菌肽有bacitracin、polymyxinE、gramicidinS和nisin等4种类型,革兰阴性菌或阳性菌均可分泌。虽然细菌的种属繁多,但产生的抗菌肽却拥有共同点,均为中性肽和阳离子肽。1.1.2“trans”的药物组成迄今已有8个家族抗菌肽在植物中被发现,即thionins、displayhevein、plantdefensins、lipoidtransferproteins、IbAMP、knottin-like、moltinghormone和MBP1。与动物源和细菌源抗菌肽比较,植物源抗菌肽对于真菌具有很高的抑杀活性。植物源抗菌肽均含有大量半胱氨酸,并形成2个~6个分子的内二硫键稳定结构。玉米种子中分离的MBP2和Impatiensbalsamina种子中分离的lb2AMPs,仅含有4个半胱氨酸,可抑制革兰阳性菌和真菌生长。1.1.3抗菌肽的来源及其结构目前已在软体动物、节肢动物(包括昆虫和甲壳动物)、鱼类、两栖动物、鸟类、哺乳动物包括人类中发现抗菌肽存在。海洋软体动物是抗微生物肽的重要来源,根据目前已发现的贻贝抗菌肽的一级结构和性质可分为贻贝素(mytilin)、贻贝肽(myticin)、防御素(defensin)和贻贝霉素(mytimycin)等4类,并且均是小分子多肽。毛文君等研究表明,抗菌肽能够抑制移植性肿瘤的生长,使得小鼠的存活时间延长。昆虫源抗菌肽是昆虫遭受刺激或感染后,由血淋巴产生的一类多肽,具备广谱抗菌活性。依据结构特点,可将昆虫源抗菌肽分为4种:①不含半胱氨酸残基的抗菌肽(代表物为天蚕素);②富含半胱氨酸残基的碱性多肽(代表物为防御素、死亡素);③富含甘氨酸残基的抗菌肽(代表物为双翅肽、攻击素、麻蝇毒素Ⅱ);④富含脯氨酸残基的抗菌肽(代表物为蜜蜂肽)。甲壳动物源抗菌肽的研究较少,但大量证据显示甲壳动物中存在具备抗微生物活性的物质。Jayasankar等从锯缘青蟹(ScyllaserrataForskal)精液分离到一种能抑制常见海洋细菌的抗菌肽。相建海等从中国对虾中克隆出抗菌肽基因,并依据脱氧核糖核酸序列推测其氨基酸序列,从而发现中国对虾含有的抗菌肽氨基端富含脯氨酸和甘氨酸。鱼源抗菌肽的种类繁多,比较目前已知的鱼源抗菌肽的氨基酸序列,其间同源性不大,但结构上存在一定的共性,如分子带正电,赖氨酸、精氨酸以及疏水氨基酸含量较高,分子可折叠成α螺旋等。Pardaxin是以色列研究者从豹鳎体表黏液分离获得的抗菌肽,由37个氨基酸残基组成。目前已从600余种两栖类皮肤中分离得百余种抗菌肽,例如蛙肽、爪蛙肽等。青蛙和蟾蜍可在应激、肾上腺激素、皮肤外伤等因素刺激下释放由粒状腺合成的抗菌肽。蛙皮素根据结构特征可分为众多家族,包括gaegurins、brevinvins-1、brevinvins-2、ranalexin、ranatuerins-1、esculentins-1、ranatuerins-2、esculentins-2、palustrin、japonicin-1、nigrocin-2、japonicin-2、rugosins和tempporins。近年来,3种鸡源的阳离子抗菌多肽的完全的基因编码被发现,为研究禽类甚至鸟类具备抗菌活性的多肽奠定了基础。据报道,鸡类的基因共编码了β-防御素14种,这些基因分别被命名为Gallinacin1-14,长度为86kb,氨基酸残基的数目约有63个~104个,含有许多赖氨酸和精氨酸残基,以阳离子形式存在。人源抗菌肽发现较少,主要可分为3类,即防御素、cathecidins、histatins。人源防御素又分为α-防御素和β防御素2类。从人体中性粒细胞中已发现4种防御素即HNP1~4,且HNP4的浓度要低于HNP1~3。迄今为止,cathecidins仅被发现在哺乳动物体内。除人类只含有1种(LL-37)外,其他各种哺乳动物通常含有多种cathecidins。猪源抗菌肽主要是防御素和cathelicidins家族,拥有广谱抗菌活性,主要来源于宿主白细胞﹑吞噬细胞和黏膜上皮细胞。猪的上皮β防御素pBD-1是目前在猪体内惟一发现的防御素。重组获得的pBD-1具有很强的抗菌活性,可抵抗革兰阳性和阴性菌以及真菌感染。在绵羊至少发现了10种抗菌肽基因,在绵羊和山羊体内发现有2种β防御素存在,即sBD-1~2和GBD-1~2,但其表达范围不同。已发现的牛源抗菌肽有30种,主要是气管上皮抗菌肽(TAP)、牛β防御素(BND)、肠上皮细胞抗菌肽(即肠肽素)、舌抗菌肽(LAP)及牛肽聚糖识别蛋白(BPGRPs)。1.2合成多肽的方法除可通过从自然生物中分离获得抗菌肽外,还可通过化学合成方法合成。随着抗菌肽研究的深入进行,人工合成方式已经成为以研究为目的的快速获取目的多肽的重要手段,特别是一些提取工艺复杂并低效的抗菌肽,且人工合成的多肽被证明在相应生物基质中同样具有优良的抗菌活性。但由于化学合成方法存在成本很高等问题,目前仅停留在实验室合成阶段。1.3对于化学合成方法的思考从生物体内直接提取抗菌肽的难度大,工艺要求高,难以应用于规模化生产,并且对于某些高等生物或人类源抗菌肽而言难以实现。化学合成方法虽然可作为快速获得目的多肽的重要手段,但是同样存在成本较高等问题。所以,利用基因工程方法来生产抗菌肽是一条理想途径。1.3.1融合蛋白载体的选择大肠埃希菌的原核表达系统是迄今在基因工程领域中应用最多、最完善的表达系统。融合表达可降低抗菌肽对宿主菌的毒性,增加表达产物的稳定性,是抗菌肽常用的表达策略。根据抗菌肽自身的电荷特性、结构特点构建新型表达载体,实现抗菌肽融合蛋白在大肠埃希菌中的高效稳定表达,使分离纯化步骤得到简化。WeiQD等以baculoviralpolyhedrin(Polh)为伴侣分子与线形小分子抗菌肽Hal18在大肠埃希菌中融合表达,最终以30%的高回收率得到纯度大于90%的重组肽。1.3.2工艺加工蛋白质酵母表达体系是目前抗菌肽基因工程中应用最为广泛的表达体系之一(其中主要应用酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母),具有基因操作相对简单、外源蛋白能正确加工与修饰、表达量高、营养要求低、易大量发酵培养、易纯化等优点。此外,巴斯德毕赤酵母中的表达产物可直接分泌至胞外,从而可获得较高的表达量。张素芳等将根据毕赤酵母偏爱密码子设计的magainin基因和cecA-MMIL杂合肽基因分别插入pPICZα-A质粒,在巴斯德毕赤酵母中获得分泌表达,获得具有抗菌活性的重组肽105mg/L和118mg/L。1.3.3生长迅速,培养条件简单枯草芽胞杆菌具备良好的分泌性和非致病性,拥有分泌表达外源蛋白的天然优势。其分子遗传背景清楚,生长迅速,培养条件简单,可避免表达产物对宿主菌的自身杀灭。李丽等将编码abaecin的基因插入质粒pGplat,成功构建的表达质粒电击转化至枯草芽胞杆菌,经过培养等到对鸡沙门菌、大肠埃希菌等革兰阴性菌有抑菌活性的抗菌肽abaecin。1.3.4关注公众的关注以昆虫杆状病毒作为表达外源抗菌肽蛋白的载体越来越受到人们的关注。赵昆等人工合成了抗菌肽融合基因后,利用BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,成功表达对大肠埃希菌具有抑菌活性的抗菌肽。1.4消化酶解其他方面的抗菌活性近年来,研究发现食物蛋白经酶解可制备乳源蛋白和非乳源蛋白抗菌肽。酶解法有反应条件温和、反应过程容易控制等优点。本身无抗菌作用的蛋白质可以通过改变蛋白质构型或者通过酶解方式获得抗菌活性,且具有抗菌作用的蛋白可以作为具有新功能作用和更强抗菌作用的前体物质。目前酶解法制备抗菌肽多数为消化道蛋白酶类酶解,但其他蛋白酶酶解物同样具有抗菌活性,如发现木瓜蛋白酶对脱脂乳的酶解物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌具备良好的的抑菌活性。PellegriniA等采用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解牛乳α乳清蛋白、卵白蛋白后的产物都具有抗菌活性,而卵清蛋白本身没有杀菌活性。因此,蛋白酶水解策略将开辟一条新型的大规模制备安全性高的抗菌肽的低成本道路。2抗菌肽的功能抗菌肽是动物免疫系统中的重要组成部分,其功能具有多样性。除了广谱抗菌活性外,抗菌肽还具有抗肿瘤、病毒、原虫等活性。抗菌肽的生物学功能比较广泛,主要表现为以下两个方面:2.1细胞调湿和抗菌活性在适当抑菌浓度下,抗菌肽能够与生物膜/壁组成成分或胞内细胞器等多种微生物靶位相互作用,前者破坏细胞质膜的完整性,后者干扰细胞的正常代谢活动,最终导致细菌死亡。由于在生理相关条件下,多数哺乳动物抗菌肽的直接抗菌活性是受到抑制的。GolecM的研究表明,在黏膜表面,生理盐浓度下,抗菌肽的抗菌活性受到很强的颉颃作用。因此,虽然很多抗菌肽有直接杀菌特性,但是并非所有的抗菌肽都具有直接杀菌特性而对宿主起到保护作用。2.2抗菌肽的生物学活性单纯依赖对病原特异性免疫应答不足以对抗环境中数百万种的病原微生物接触,所以具广谱抗性的抗菌肽扮演了重要的角色。研究证明,在一定生理条件下,抗菌肽具有广泛的生物学活性,包括在先天性免疫细胞中与炎症反应、先天性免疫和适应性免疫相关的活性,在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和树突状细胞中作为先天性免疫和适应性免疫沟通的桥梁。因此,抗菌肽在体内除了能以直接杀死病原菌的方式起作用外,更重要的是作为免疫效应分子来启动、调节宿主免疫防御体系,从而促进免疫功能来消除感染,保护宿主免受病原微生物侵害。2.2.1抗内毒素活性可预防内毒素血症的发生2.2.2免疫倾向活动2.2.3抗菌酶对免疫功能的影响2.2.4其他抗凝剂活性3数据库apd关于抗菌肽的研究不断深入,多个国家的研究者已建立了多个有关抗菌肽的数据库。自2002年至今建立了十多个抗菌肽数据库。经过多年抗菌肽数据库的不断更新和补充,可以通过各种数据库及时地了解抗菌肽的研究进展,包括序列比对、分析、结构预测、结构和功能关系、分子改造设计等。APD(Theantimicrobialpeptidedatabase)是专门收录抗菌肽的数据库,由美国内布拉斯加医学中心的Eppley研究所维护。作为专业的抗菌肽数据库和分析系统,目前该数据库现已收录1528种抗菌肽,主页将抗菌肽分为四类,分别为抗病毒肽、杀真菌肽、抗癌或肿瘤肽和抗细菌肽。随着抗菌肽研究领域的增长,新的抗菌肽信息不断被补充到数据库。ANTIMIC数据库是目前全球最大规模的抗菌肽数据库,由新加坡国立大学维护,其中收录了约1700种自然抗菌肽以及各种分析工具,如BLAST,3-D视图软件,还有ANTIMIC自建的一个工具界面——Antimicprofilemodule,使用起来相对于APD复杂。APPDb数据库由爱尔兰StVincent医学院维护。APPDb数据库相对于其他的数据库较小,主页面就是搜索页面,没有附带分析软件,其中Pfam数据库专门搜集大量的蛋白家族和结构域,目标是精确的描述蛋白结构域,对于研究蛋白结构的研究者来说极富参考价值。AMSDb数据库原由意大利的Trieste大学创建,现已纳入欧洲PAND工程中维护和更新。AMSDb中有基因编码的抗菌肽及抗菌蛋白,还有暂定的抗菌肽前体,暂定或假设的抗菌肽是由DNA序列翻译而来,并非天然源抗菌肽。另外,AMSDb中的抗菌肽是植物和动物源的抗菌肽,没有微生物源抗菌肽。SAPD(Syntheticantibipticpeptidesdatabase),由芬兰的DavidWade创建,专门记录人工合成的抗菌肽。在数据库中拥有许多人工合成的抗菌肽序列结构、活性、药物试验、多肽设计等宝贵资料。CyBase(Thedatabaseofcyclicproteins),由澳大利亚昆士兰大学分子生命科学院管理,专门研究环肽类的环状蛋白序列和结构数据库。Defensins数据库是指DEFENSINSKnowledgebase,是一个Manuallycurateddatabase,且专门提供防御素家族抗菌肽的信息资源,目前版本的数据库全面收集了363种防御素,记录了每一种防御素所包含的序列、结构和活性信息。PenBase(Penaeidindatabase)是专用于penaeidins的curated数据库。PenBase提供关于penaeidin属性、功能、多样性和命名原则的综合信息。PenBase包含由小群或虾种类列出所有已知的penaeidins抗菌肽的一个数据库部分。Peptaibol数据库(Peptaiboldatabase)是专门收集peptaibols的抗菌肽数据库,生物信息学资源来自英国伦敦大学Birkbeck学院。随着抗菌肽研究的深入进行,研究者需要一个专业的专门的存储抗菌肽的数据库,以便整合抗菌肽信息资源。目前有关抗菌肽数据库已超过10个,今后这一数字还将会增加。4gainin,colib尽管一些具备较好的体外抗菌活性的抗菌肽已进入临床超过10年有余,如magainin,protegrin,indolicidin等,但仍存在诸多问题,限制其发展和应用。真正将抗菌肽从实验室推向市场,将抗菌肽基础研究成果转化成产业,可能还要面临许多挑战,必须继续深入研究以下几个问题。4.1抗菌肽的合成抗菌肽大规模临床应用的最首要的问题是高生产成本。其一,抗菌肽在生物体内天然含量极少,天然资源有限;其二,抗菌肽分子质量小,提取步骤烦琐且效率低,工艺要求高;其三,化学合成法成本高,价格昂贵。而通过基因工程在工程菌中直接表达抗菌肽基因,易被蛋白降解,且产物可能对宿主具有毒性,从而影响基因的高水平表达。如何提高抗菌肽的产量,降低生产成本等问题成为目前抗菌肽生产实践应用中的瓶颈。Roche公司采用固相-液相结合的方法实现吨级生产的一种HIV结合抑制肽——T-20。Novozyme公司报道其利用真菌表达系统表达了符合临床给药要求的高产量及高活性plectasin,plectasin是第一个具有临床应用潜力的真菌防御素,动物试验证实了其在治疗细菌性腹膜炎和肺炎的治疗效果。4.2潜在的致畸性问题抗菌肽是否会成为一种强致敏原,抗菌肽用于人体后是否还有理想的活性,抗菌肽是否有潜在的致畸性或致癌性等一系列问题都有待于进一步研究。另外,由于许多天然抗菌肽都具有溶血性而不利于其在动物和人体的临床应用。通过改造抗菌肽的结构使之既保持抗菌活性又丧失毒副作用,是一种克服抗菌肽毒副作用的有效方法。4.3抗菌类抗菌肽的合成抗菌肽的多样性及其独特作用机制的差异预示着天然细菌群体对其产生抗药性十分困难。不过自然界总存在着一定的病原微生物,由于十分稳定的细胞膜结构或功能性特点使之具有天生的耐药性。目前已经证明金黄色葡萄球菌除可分泌蛋白酶降解防御素和一些人源抗菌肽产生耐药性外,还可以通过调节vraDE和vraSR改变膜的转运作用而产生对蛙类抗菌肽temporinL和dermaseptinK4-S4的耐药性。这表明抗菌肽在临床应用时,也有可能导致耐药细菌的产生,尽管其机率比传统抗生素而言小得多,但也提醒了我们在用抗菌肽进行治疗时应进行严格的控制,以避免耐药性的出现。4.4抗菌肽的生理作用蛋白质类物质在体内涉及到许多酶化学反应,抗菌肽经口服或注射途径进入体内后,有可能被体内的蛋白水解酶降解而使其抗菌活性降低,也可能通过与体内某些蛋白质结合最终使其丧失抗菌活性。设计开发同时具有抗菌活性与胰蛋白酶抑制剂活性的双功能多肽,为解决抗菌肽作为替代抗菌药物在体内使用遇到的蛋白酶水解问题提供了新的方法。此外,抗菌肽作为药物,对其药效学及药物代谢动力学的研究还存在不足,蛋白质类的抗菌肽在生产、保存、运输、给药时极易变性失活,如何保持其活性也是需要进