反相高效液相色谱分离制备多肽

反相高效液相色谱分离制备多肽

1多肽的分离纯化和制备随着现代生物技术的发展，出现了几种多媒体药物，多媒体药物在临床医学中具有重要的应用价值。自从发明固相法化学合成多肽以来,有关各种活性多肽的化学合成有了很大发展,但产物成分比较复杂,一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物,因此,对这一混合物的分离纯化一直是一个重要的研究课题,对其分离纯化的最优化研究就显得格外重要。此外,提供高纯度的多肽样品,对于其物化性质、生物活性及其医药功能的研究具有重要的作用。从现代分离科学理论得出,色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法。电泳仅能用于分离而不能用于多肽的制备。反相高效液相色谱(RPLC)具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点,在多肽的分离纯化和制备中备受青睐,因此,RPLC是目前分离纯化和制备多肽的主要手段。本文拟用RPLC对化学合成的32肽和21肽进行分离、纯化和制备。2实验部分2.1反相色谱填料的填充SCL-10AVP液相色谱仪(日本岛津公司),包括系统控制器、LC-10ATVP色谱泵、进样阀、SPD-M10AVP二极管阵列检测器,CLASS-VP5.33色谱工作站。色谱柱为200×4mmI.D.的不锈钢管,用匀浆法装填德国进口Nucleosil4000-7C18反相色谱填料。KQ-250型超声波清洗器(昆山市淀山湖检测仪器厂),TLL-C台式冷冻离心机(军事医学科学院实验仪器厂),BarnsteadE-Pure纯水器(美国Barnstead公司)。2.2nh2-glu-gly-gly-ala-gly-ala-cys-gly-ala-ala-trt-ala-ala-cohs色谱纯乙腈(天津科密欧科技有限公司);三氟乙酸(TFA)(美国Sigma公司);合成的32肽、21肽粗品由西安美联公司提供。其氨基酸序列如下所示:32肽:NH2-Glu-Gly-Ile-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Pro-Thr-Gly-Leu-Arg-Gln-Ala-Cys-Gly-Gly-Ile-Glu-Gly-Pro-Arg-Thr-Leu-Gln-Ala-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-COOH;21肽:Trp-Pyr-His-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Trp-Ser-Leu-Tyr-D-Lys-Arg-Pro-Gly-Gln-His-Arg-Cys-Pro-Gly-NH2。2.3色谱条件[0.2%]v/v/%将合成多肽粗品用含乙腈水溶液溶解后,离心,保留上清液,弃去沉淀。取一定浓度的多肽样品溶液进样至已用流动相A液[水+0.1%TFA(V/V/%)]平衡过的RPLC色谱上,然后进行线性梯度洗脱直至达到要求的B液浓度[乙腈+0.1%TFA(V/V/%)]。流动相A、B液需超声脱气后使用。收集各色谱馏分进行检测,再用100%B液洗脱10min,使残余在柱上的物质完全冲洗下来,然后再用相应浓度的A液使柱平衡,以构成一个完整的色谱过程。流速1.0mL/min,32肽的检测波长为215nm,21肽为280nm。3结果与讨论3.1色谱馏分的定性分析以乙腈作为流动相,用RPLC对合成的32肽和21肽的粗品进行分离。图1和图2分别是32肽和21肽的RPLC色谱分离图。从图1和图2对两种多肽的分离结果可看出,二者的组成都比较复杂。由于没有32肽和21肽的标准品进行对照,无法确认32肽和21肽的目标峰,因此必须收集主要的色谱馏分并对各色谱馏分进行定性分析,以便确定目标多肽色谱峰的位置。分别收集图1和图2所示的各色谱馏分,冷冻干燥处理后用飞行质谱对各色谱馏分的分子量进行测定(质谱图未给出)。结果表明图1中的色谱峰3和图2中色谱峰2的馏分的分子量分别与合成32肽和21肽的分子量完全吻合,表明图1中的色谱峰3和图2中的色谱峰2分别是32肽和21肽的目标峰。3.2rlc对多媒体的制备3.2.1线性梯度条件的选择从图1和图2可看出,32肽和21肽的组分都较复杂,需要选择合适的色谱条件对其进行最优化分离,这样才能用最少的分离步骤和最短的时间得到合格的产品。由于32肽与杂质组分的性质非常相似,虽然选择不同的梯度方式,用RPLC对32肽的分离效果还是得不到改善。而从图2可看出,只要选择适当的色谱条件,就可使21肽的目标峰(峰2)与杂质峰得到分离,因此对其梯度方式进行了选择。我们选择了6种线性梯度方式,并用RPLC对21肽进行分离。除图2给出的1种线性梯度方式外,图3还给出了两种线性梯度下,RPLC对21肽粗品的色谱分离图。比较图2和图3可看出,采用图3b所示的线性梯度方式,可对21肽进行较好的分离。3.2.2肽和21肽的进样量对分离效果的影响由于没有制备型的反相色谱柱,所以我们用分析型的反相色谱柱通过多次收集样品组分制备多肽。只要在保证柱子对样品的基本分离效果的前提下,尽可能多的进样,就可一次制备更多的样品,从而缩短制备时间,故应对进样量进行选择。32肽和21肽的进样量分别为1.0mg,2.5mg,3.0mg,3.5mg和5.0mg。当进样量大于5.0mg时,分离效果逐渐变差,因此,32肽和21肽制备时的进样量为5.0mg。通过多次分离纯化,对32肽和21肽的目标峰进行了大量的收集,然后将所收集的样品进行冻干,除去水和有机溶剂。3.2.3肽的分离纯化用RPLC对32肽和21肽冻干样品的纯度进行分析检测,分离结果如图4和图5所示。从图5的分析结果可看出,21肽的纯度为98.6%,达到了产品纯度95%的要求,因此,用上述方法用4天时间通过42次的分离纯化共制备了高纯度的21肽100mg。而图4中32肽的纯度只有80%左右,达不到95%的纯度要求,因此需要对其进行二次纯化和制备。3.3肽的色谱分离32肽经RPLC分离纯化后,其纯度仅有80%左右,还含有较多杂质,因此需对其进行二次纯化和制备。为了更好地分离纯化32肽,必须对其分离条件再次进行优化。首先,对其分离梯度模式进行选择,分别选用了5种线性梯度,线性梯度模式分别为:(1)10%→60%B,30min线性;(b)20%→60%B,30min线性;(c)30%→60%B,30min线性;(d)20%→40%B,30min线性;(e)25%→35%B,30min线性。图6给出了3种梯度模式下32肽的RPLC色谱分离图。从图6可看出,用梯度e可使32肽与杂质进行有效分离,因此选用梯度e对32肽进行二次分离纯化。当32肽冻干样品的进样量超过5.0mg时,样品的分离度大大