苏大创申报书 人源乳腺痘小鼠昇种移植模型建立的硏究

—PAGE4——PAGE5—附件1:大学生创新创业训练计划项目申报表推荐学校项目名称人源乳腺痘小鼠昇种移植模型建立的硏究项目类型项目负责人申报日期陕西省教育厅制二○年月项目名称项目类型（）创新训练项目（）创业训练项目（）创业实践项目是否为“青年红色筑梦之旅”项目（）项目实施时间起始时间：年月完成时间：年月申请人或申请团队姓名年级学校所在院系/专业联系电话E-mail主持人成员指导教师姓名研究方向年龄行政职务/专业技术职务主要成果项目实施的目的、意义现代社会中,生活水平和物质供给大幅提高,但伴随而来的是脂肪和膳食能量的摄入过量.尤其是像我国这样的发展中国家,城市化比例提高带来的是人们生活节奏的加快和压力疲劳感的增加,导致生活的规律性变差,近年来高烹调油高盐高能量的外卖在日常饮食中的比例越来越大.高脂膳食导致的氧化应激和伴随而来的多代谢系统异常而现代营养学和医学更倾向于通过饮食干预的手段,增强食源性功能因子的摄入来改善这种状况。胶原蛋白肽具有广阔的市场应用和发展前景,其调节皮肤和骨骼等方面的研究和开发利用已经比较成熟.希望为胶原蛋白肽的应用提供更多的理论依据.项目研究内容和拟解决的关键问题不合理的膳食结构是导致机体脂代谢紊乱的重要原因,研究表明当机体脂肪摄入量增加时,会伴随着脂肪合成代谢水平的显著升高,并且脂肪分解代谢水平不会一起增加,而临床给予肥胖患者低脂饮食就有减轻体质量的效果Friedrich和Zhang的研究表明高脂膳食会导致肝脏中脂肪合成相关酶SRBPs、ACCs和FAS的基因表达水PPARO、CP解相关酶的基因表达水平明显上调,并伴随着PPARα、CPT1等脂肪分解相关酶的基因表达水平显著下调。因此,高脂膳食是造成机体脂代谢紊乱的主要诱因,研究功能因子调节脂代谢的作用经常需要围绕高脂膳食展开.项目研究与实施的基础条件四、项目实施方案（一）实验动物分组及饲喂动物饲养于武汉大学动物实验中心,购自武汉大学生物医药研究院.参考AIN9纯合氨基酸日粮标准和Hasek等的饲料配方进行饲料配制13.正常饲料适应性饲喂周后,按体质量随机分为3组,每组18只:正常膳食组(CON组,4%脂肪);高脂膳食组(HF组,20%脂肪);FCPs干预高脂膳食组(PHF组,20%脂肪+1%FCPs).PHF组的纯合氨基酸添加量扣除所加FCPs中各种氨基酸的量,其中添加的脂肪均为猪油.正常饲料的供能总量为3.87kcal/g,脂肪供能比为1.63%;HF组和PHF组饲料的供能总量为467kcal!g,脂肪供能比为38.54%.饲养条件:SPF级动物房,所有小鼠共处一室,每组六笼,一笼三只,自由摄食和饮水,环境温度23±2℃,相对湿度50±10%,12h/12h昼夜循环光照,每周称重并记录体质量,并在第7、14和21周记录小鼠的日采食量.所有饲喂和实验操作均符合武汉大学实验动物管理委员会工作章程。（二）CLAMS监测小鼠代谢状态饲喂至第21周时,每组选择4只小鼠,按系统操作说明进行实验.待小鼠适应24小时后,监测并记录小鼠的每小时氧气消耗量(VO2)、单位时间二氧化碳产生量(VCO2)和自主活动量.监测持续24小时通过公式1计算小鼠的呼吸交换率(respiratoryexchangeratio,RER),按公式2计算小鼠的能量消耗(Heat).（1）（2）（三）脂肪表观消化率实验在第11周和第22周时,每组小鼠取6只,放入提前消毒好的代谢笼中适应3天.开始实验后,收集每只小鼠72h的粪便待测.整个实验流程中所有小鼠均自由采食和饮水分别将每只小鼠的粪便样品磨碎后各取1g,精确称重,包入滤纸后在铝盒中105℃烘干至恒重,记录重量,将滤纸包放入索氏抽提器中进行脂肪抽提4h以上,至回流液滴在滤纸上挥发后没有油印为终点.再次将滤纸包烘至恒重后记录重量,前后两次恒重后的重量差即为粪便中的粗脂肪含量.按公式3计算小鼠对饲料中粗脂肪的消化率（3）（四）实验样品采集1.血液样品采集所有小鼠每周称重并记录体质量,每组按体质量随机分为两批各9只,分别于饲喂1l和22周后禁食12h,摘眼球取血于肝素钠抗凝管中(4℃,3000pmn离心10min后取血浆-80℃保存备测),小鼠断颈处死.2.组织样品采集小鼠处死后在冰浴条件下迅速摘取肝脏,称重记录后取部分肝脏组织按1:9(W/V)加入4℃预冷的生理盐水(0.9%)制备10%组织匀浆,4℃,3000pm离心10min取上清-80℃保存待测生化指标.取相同部位和大小的两块肝脏组织分别放入4%多聚甲醛固定液和冷冻固定液中待组织切片观察.再取100mg左右肝脏组织于TrizolI中剪碎,连同Trizol放入灭酶EP管中,液氮速冻后-80℃保存待RNA提取其余肝脏样品直接-80℃保存备用.冰浴条件下迅速摘取小鼠甲状腺于Trizol中剪碎,连同Trizol放入灭酶EP管中,液氮速冻后-80℃保存待RNA提取。3.代谢组学样品采集第22周宰杀时,取100迁血浆加人500迁生理盐水(含5%重水),并在漩涡混匀仪上充分混匀.4℃,100g高速冷冻离心10min,取50μL上清液于5mm核磁管中备测.第22周宰杀前,收集小鼠尿样并加入0.1%的叠氮钠溶液防腐,保存样品于-80℃测试前取200μ样品加入350μL重水和50μL的PBS(15MNaK,pH=7.4,含0.1%TSP)充分混匀后静置10min.4℃,11000g高速冷冻离心10min,取550uL上清液于5mm核磁管中备测.（五）指标测定如（1）结果表明,高脂膳食饲喂小鼠可以导致明显的肝脏质量增加和肝脏脂肪空泡面积比与脂肪浸润面积比升高.rCPs干预尽管没有降低肝脏的质量,但明显降低了高脂膳食小鼠的肝脏脂肪空泡面积比和脂肪浸润程度,有效减轻了非酒精性脂肪肝的发展程度并且随着饲喂周期变长,改善的效果也更加明显,表明FCPs具有改善高脂膳食小鼠脂代谢,减少肝脏脂肪蓄积的作用.注:图a、b分别为小鼠肝脏的HE和油红O染色切片.注:图a、b分别为小鼠肝脏的脂肪空泡面积比和脂肪浸润面积比.五、学校可以提供的条件六、预期成果结果表明,高脂膳食引起的小鼠体重增长与饮食能量增加有一定的关系,但更主要的因素是膳食结构中脂肪供能比例的变化.FCPs干预虽然没有引起高脂膳食小鼠体质量的减少,但结合采食量和日均采食总能的数据可以发现FCPs依然对小鼠的能量代谢有调控作用.七、经费预算八、导师推荐意见签名：年月日九、院系推荐意见院系负责人签名：学院盖章年月日十、学校推荐意见学校负责人签名：学校盖章