神经生长相关蛋白与突触可免性

神经生长相关蛋白与突触可免性

相关的神经生长蛋白（dap-43）和相关的神经诱生素（cdam）与轴突生长密切相关，对触觉可塑性影响重要。GAP-43是脊椎动物神经细胞膜上一种特异性磷蛋白,在脑中分布广泛但不均一,在神经系统的发育和损伤再生等事件中,常能监测到GAP-43在mRNA和蛋白水平上的明显升高,国际上将GAP-43列为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针。NCAM神经细胞黏附因子是细胞表面糖蛋白大家族的成员之一,对长时记忆的保持有重要影响,其功能的实施需GAP-43的调节作用。二者与突触可塑性密切相关,综述如下。1海胆排酸酶基因中的小体结构及神经纤维网高表达1.1GAP-43的结构及生化特性含有226~243个氨基酸,只一个芳香族氨基酸残基而Ala、Glu、Lys和Pro的含量极丰富。其分子质量为24ku,等电点4.3~4.5。GAP-43在脊椎动物非神经组织很少表达,所以被认为是神经系统特异性蛋白。根据克隆到的大鼠、小鼠、牛以及人等的cDNA序列,不同物种GAP-43一级结构具有高度的同源性,活性位点基本一致,氨基末端的短水解区是与膜结合位点,第41位丝氨酸是PKC催化的磷酸化作用活性位点,第43~51位氨基酸构成与钙调素的结合位点。二级结构以无规则卷曲为主,整个分子呈棒状,具有很强的柔性。编码GAP-43蛋白的基因位于人的3染色体(HSA3),在小鼠中位于16染色体,人和大鼠的GAP-43基因均为单拷贝,包括2个启动子和3个外显子,第1个外显子编码第1~10氨基酸,包括蛋白的膜结合域和G0、Giα1活性域。第2个外显子编码蛋白的大部分,包括CaM的结合点以及PKC磷酸化位点。第3个外显子编码蛋白的羧基末端,其中包括一个F-motif,猜测它可能与细胞骨架成分相互作用。GAP-43具有高亲水性并可能通过与膜脂肪酸共价连接而与神经元膜结合,它在突触前膜和生长锥的动态结构中含量极高,胞浆中含量极低,这符合人们对其构型的一设想模式,即:GAP-43从生长锥或突触膜表面伸展开来,一方面与胞质及细胞结构蛋白相互作用,另一方面,它可逆的附着在膜表面。1.2GAP-43与突触可塑性大体有两种类型突触可塑性变化与GAP-43的表达相关,首先突触形态结构变化可导致GAP-43表达的升高,如神经系统发育过程中神经的分化,轴突再生以及神经受损后的修复。其次,由LTP和LTD所引发的突触效能的变化,可影响GAP-43的磷酸化状态和mRNA的表达。曾有研究发现,GAP-43不存在于神经干细胞和成神经细胞中,只存在于已分化定型并开始轴突生长的神经元中,并且不依赖于神经元的胚胎起源,这提示GAP-43在新生神经元的轴突生长、发育中起作用。大鼠GAP-43在神经纤维网高表达的时期与轴突的延伸生长、突触形成的起始密切同步,大鼠脑发生区神经元未延徙和最终分裂之前,几乎无GAP-43及其mRNA的表达,即使神经元完成了有丝分裂,在其突起长出之前,也很少见其中有GAP-43表达。分化一旦开始,胞体和初生突起中便可见大量的GAP-43,这明显显示出GAP-43与神经发育密切的关系。另外,与GAP-43磷酸化的变化密切相关的生理现象之一便是突触传递的长时程增强即LTP。在海马CA1区高频刺激诱导出LTP(这其中需要NMDA受体的激活),之后,对GAP-43磷酸化程度进行监测发现,大鼠海马脑片CA1区僵直刺激后10~60min可导致GAP-43磷酸化的提高,至120min后不再增长,用NMDA受体阻断剂AP5抑制LTP后,GAP-43磷酸化的提高也受到抑制,如僵直刺激没有诱导出LTP,则GAP-43磷酸化程度也没有呈现出相应的提高。这说明GAP-43磷酸化程度与LTP的表达正相关,而非僵直刺激所致。而且海马脑片中GAP-43磷酸化升高的幅度与兴奋性突触后电位(EPSP)的斜率,在僵直刺激60min内呈现出相关性提高。GAP-43磷酸化的提高依赖突触后NMDA受体的激活,以及逆行性信使的作用,如花生四烯酸(AA)和NO,但其在LTP过程中刺激GAP-43磷酸化的特别角色尚待深入研究。1.3GAP-43的一个作用模型是特异性存在于神经系统中的参与细胞形态和连接的调节蛋白,许多由GAP-43所参与的过程看起来并不相关,从生长锥形态的调节、细胞骨架结构的变化到其与钙调蛋白的结合,以及对神经递质释放的调节,而且LTP诱导后GAP-43磷酸化水平提高。所有GAP-43这些功能体现,一方面可能它们互相独立,表现出GAP-43的多功能性,另一方面也可能是GAP-43的单方面功能在多个过程中的体现。由此演绎出GAP-43对于轴突的长出和突触可塑性的作用的综合表达模型(见图1)。(1)GAP-43作为一个位于生长锥和突触前末端中的钙调素结合蛋白,与质膜相连。当钙通道打开以及钙离子在受体激活后由细胞内库释放,生长锥或突触前末端的钙离子浓度提高,CaM从GAP-43释放。(2)钙调蛋白从GAP-43释放可能触发PKC对GAP-43的磷酸化。蕈毒碱受体和/或代谢性谷氨酸受体的激活对GAP-43磷酸化具调节作用。(3)PIP2在磷脂酶C(PLC)催化下可水解产生甘油二酯(DAG)和三磷酸肌醇(IP3),后者可作为钙离子释放信号。PKC磷酸化GAP-43可抑制生长锥和成年脑中的磷脂酰肌醇(PIP)激酶活性、减少PIP2的形成,这对于受体介导的GAP-43磷酸化级联反应提供了一个负反馈。同时,PIP2通过影响肌动蛋白的聚合作用和G蛋白的激活介入轴突生长,而且,PIP2看起来在突触小泡溶和中起关键性的作用。(4)从GAP-43释放的CaM刺激了F-肌动蛋白和微管蛋白的聚合作用,这可能导致细胞骨架的修饰,对于GAP-43所促进的膜扩展延伸过程具重要意义。而这些CaM介导的细胞骨架构筑的变化可能是GAP-43所导致的许多系统形态变化的主要原因之一。(5)细胞骨架和亚膜骨架蛋白包括F-肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白、CaM结合蛋白,它们在生长锥功能以及胞饮/胞吐中扮演重要角色。GAP-43是与F-肌动蛋白结合的蛋白之一,如上所述,GAP-43与CaM的动力学结合/离解过程在细胞骨架的重组中扮演重要角色,尚不知是否此结合对GAP-43与F-肌动蛋白的结合有所影响。(6)从GAP-43释放的CaM可作为不同酶的激活剂,如c-AMP磷酸酯酶,CaM-依赖性蛋白激酶和CaN等,它可激活参与轴突生长和胞饮/胞吐膜再循环的过程,其中后者参与了小泡溶和、神经递质的释放。AB-50localizationinthegrowthcone/axonandthepresynapticterminal.BUnifyinghypothesisshowingtheinvolvementofB-50inprocessescommontothegrowthconeandthepresynapticterminal.(7)神经递质释放的增加会伴随GAP-43磷酸化的提高,成年大鼠海马脑片和皮层突触小体中GAP-43磷酸化的提高与神经递质释放的增加相关。反之,GAP-43磷酸化程度也可局部调节神经递质释放量以及CaM的作用。(8)Ca2+以及CaM水平的提高可激活CaN,它可使GAP-43及dynaminⅠ去磷酸化,dynaminⅠ对神经递质小泡的泡饮很重要。(9)Ca2+浓度的提高刺激Ca2+依赖性蛋白酶,如calpain,使GAP-43水解。总之,生长锥的形态学和轴突的长出看起来主要被GAP-43的表达水平调节,GAP-43的独特性质在于它是突触前末端的生长相关蛋白,与膜联合,与CaM结合,GAP-43不直接参与膜骨架蛋白的聚合作用,但可释放CaM,CaM刺激肌动蛋白和微管蛋白的聚合作用,而且GAP-43参与了膜的扩展、神经递质的释放,作用于胞吞/胞吐过程,通过小囊溶和或诱导生长锥和突触前末端的胞吞促进膜扩展。GAP-43作用过程中,PIP2、CaM以及G蛋白、细胞骨架蛋白贯穿其中,构成GAP-43的紧密级联作用体系。2接触弹性和rcm2.1ncams的结构NCAM是细胞表面糖蛋白大家族的成员之一,由一个含有26个外显子的单拷贝基因进行选择性拼接,产生出至少20~30个同位体。NCAM基因中vase外显子,可通过选择性拼接插入到NCAM的不同位置并因此表现出不同的功能:插入到NCAM分子中调节同源亲和性结合的决定簇附近,可调节NCAM分子之间的识别;插入到NCAM中类似免疫球蛋白分子的高变区,可参与一些新的相互作用,它与NCAM的-CH2残基的连接位点非常邻近,可改变后者的构型、定向及其连接特性。NCAMs为一组多肽链,含有与免疫球蛋白和纤连蛋白决定簇相关的结构。每条链都有5个连续的同源区,区内有一个链内二硫键,5区之后为类似于纤维黏连蛋白Ⅲ重复系列的重复区。不同肽链的差别既表现在胞浆区的不同,也表现在与细胞膜连接的方式不同。如鸡NCAMs的3个多肽,其胞外区相同,是跨膜区和胞内区不同,两个较大的多肽以胞浆段整合到膜蛋白,其中较大者(ld)在胞浆区有261个氨基酸,较小的多肽(sd)则没有,最小的多肽(ssd)无跨膜区,无胞浆区。ld和sd整合到膜上,能运动,可被脂肪酸酰化,ssd无跨膜区,但锚在磷脂上,更易于在膜表面运动。sd和ld胞浆区可与细胞的有关分子相互作用,发生丝、苏氨酸的磷酸化,其中ld含有更多的磷酸化位点。NCAMs的三维结构电镜分析表明:其分子末端有一段铰链结构,有助于在细胞形态改变时易化跨膜的同种亲和。2.2ncam对突变塑性的作用有几方面的试验事实支持NCAMs在突触可塑性和记忆中的作用:①在某些持续性突触发生和可塑性的脑区有与轴突在发育阶段生长类似的特征性NCAM表达。②在突触可塑性和学习中可监测到NCAM表达或翻译后修饰。③特异的针对NCAN或相应合成多肽的抗体可阻止LTP的产生(当LTP已形成时,其维持不受此类抗体影响)。④NCAM基因缺损小鼠,具学习记忆及行为障碍,形态学研究显示,其海马苔藓纤维异变,海马脑片电生理研究也显示出与对照组相比呈现明显突触传递抑制。NCAM参与突触可塑性有两个机制:①NCAM介导的细胞骨架动力的改变,涉及活动依赖性突触重建。N-粘着蛋白的胞浆区直接与细胞骨架作用,而NCAM、L1的胞浆区直接与ankyrins(位于特异胞膜区的胞浆表面的spectrin结合蛋白家族的一员)相连。②为胞内信号系统。其具如下特点:胞内信号改变可反馈到突触后膜,通过NCAM调控细胞与细胞的黏附,迅速改变突触的结构和效能。胞内蛋白水解酶calpain水解NCAM的胞内区,可较快地解除和重新组织突触的结构联系。使用相应的可溶性NCAM的抗体作用于神经元可触发许多第二信使水平的改变,继而产生级联反应,导致突触效能的改变。试验中成纤维细胞生长因子(FGF)受体抗体抑制NCAM所介导的轴突生长,FGF受体的激活可增大NCAM的刺激作用。另外,花生四烯酸(AA)在NCAM刺激的轴突生长过程中起核心作用,且促进PKC对作用底物GAP-43的磷酸化,PLC及D