第二章 遗传的物质基础DNA2

第二章遗传的物质基础一．遗传物质的发现ThetransformingprincipleisDNA.ThegeneticmaterialofphageT2isDNA.二．核酸的结构及理化特性以四种碱基构成的脱氧核苷酸或核苷酸为基本单位通过3，5-磷酸二酯键连接成链状结构构成其一级结构DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化(mythylationofDNA)。

1）原核生物（细菌）有限制一修饰系统①对自身DNA产生保护作用。

②抵御外源DNA（噬菌体）的入侵。

2）真核生物中的DNA甲基化在基因表达调控中有重要作用NucleicAcidStructureDNAdoublehelixWatsonandCrick,1953.TwoseparatestrandsAntiparellel(5’

3’direction)Complementary(sequence)Basepairing:hydrogenbondingthatholdstwostrandstogetherEssentialforreplicatingDNAandtranscribingRNASugar-phosphatebackbones(negativelycharged):outsidePlannerbases(stackoneabovetheother):inside三级结构：即超螺旋结构（Supercoiling）三链、四链结构：三链DNA、端粒RNA结构:

许多RNA分子以一单链状态存在,其通过分子内碱基的配对和相互之间的氢键结合，形成复杂构像，而这种复杂性反映在细胞中RNA分子呈现不同角色的变化中。tRNARibozymeRNArRNA核酸的理化性质物理性质：a.核酸具有高度的粘性，这主要是因为其有高螺旋率和相对僵硬的缘故；b.其浮力密度为1.7g/cm-3，可通过密度梯度离心获得DNA；c.核酸具有旋光性和热特性，DNA和RNA的最大吸收波长均为260nm（用于定性定量检测核酸，测定核酸纯度），减色现象：双链DNA与单链DNA或RNA以及单个核苷酸相比，表现为着色不足，因此对紫外线吸收的程度是dsDNA<ssDNA/RNA<nucleotide.在加热的情况下DNA会发生变性成单链，温度降低又可复性（回复双链结构）。d.超螺旋：非正常的螺旋状态，其中负超螺旋是进行复制和转录的基础，约占整个DNA的5%。化学性质：在pH4-11范围内比较稳定，过酸或过碱都会使其变性。碱变性提取细菌质粒DNA即是基于此原理。（一）核酸扩增、杂交变性，复性——PCR的依据解链温度杂交——southern，northern，而westernblot虽与上述杂交相似，但所依据原理不同C0t1/2是指什么?三、核酸扩增杂交基础及测序核酸分子杂交的基本原理

具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。探针带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子反应。杂交有固液相杂交和液相杂交。变性复性DNA-DNA杂交双链分子DNA变性与复性

1、DNA变性

（1）定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性（2）变性的方法：

a.热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。

b.酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。

c.化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。(3)变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(4)DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线(5)GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.32、复性

（1）定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。（2）复性过程A.单链分子间碰撞形成局部双链B.局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离C.局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列D.形成完整的双链分子3、核酸变性后的复性速度取决于核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度（2）Cot½与反应体系中核酸复杂性成正比（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性Southern印迹杂交1、待测核酸样品的制备

（1）裂解或破碎细胞

（2）抽取纯化基因组DNA

（3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段杂交举例2、待测DNA样品的电泳分离

（1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶（2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子

DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带

（3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记

3、凝胶中核酸的变性（碱变性）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液

4、Southern印迹根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片

5、Southern杂交

（1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液

（2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交

（3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA

6、杂交结果检测（1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片

水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。Southern杂交分析示例

A.DNA体外重组实验

B.抗生素筛选转化子细胞

C.培养突变株细胞

D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。Northern印迹杂交1979年，J.C.Alwine等人发展而来，与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）。1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNANorthern印迹与Southern印迹的不同点

1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性

2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理

3、靶核酸为RNADNA芯片（基因芯片）DNA芯片（DNAchip）技术，实际上就是利用核酸杂交的原理，将不同序列的DNA片段（探针）印记到小玻片或相应介质上，然后将待检测DNA（带有标记）液与之孵育，经洗脱后，检测最终能够发生结合的DNA，从而判定待检测DNA序列的技术。（二）核酸测序Sanger的酶学测序原理

Gilbert的化学测序法自动测序仪的发明DNA序列测定常用方法有如下3种：1、末端终止法2、化学裂解法3、DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。1、高负荷，1块胶可测16个样品；2、机读不需放射自显影；3、安全不用同位素；4、简单迅速8-10h。测序