梅毒实验室诊断-张国强

湖南省疾病预防控制中心地址：长沙市芙蓉中路一段450号1201室（410005）电话南省疾病预防控制中心性病艾滋病防治科张国强梅毒实验室诊断梅毒的临床分期

一期梅毒早期梅毒二期梅毒后天梅毒（病期在2年以内）早期潜伏梅毒

晚期梅毒心血管和神经梅毒、（病期在2年以上）晚期潜伏梅毒等梅毒

先天梅毒早期胎传梅毒（出生后2年以内发病）晚期胎传梅毒（出生后2年以后发病）一期梅毒实验室检查：1暗视野显微镜检查：皮肤黏膜损害或淋巴结穿刺液可查见梅毒螺旋体。2非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。如感染不足2～3周，该试验可为阴性，应于感染4周后复查。3梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。诊断标准疑似病例：应同时符合梅毒流行病学史、临床表现和2项。确诊病例：应同时符合梅毒流行病学史、临床表现和1、3中的任一项。二期梅毒实验室检查：1暗视野显微镜检查：二期皮损尤其扁平湿疣、湿丘疹及黏膜斑，易查见梅毒螺旋体。2非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。3梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。诊断标准疑似病例：应同时符合梅毒流行病学史、临床表现和2项。确诊病例：应同时符合梅毒流行病学史、临床表现和1、3中的任一项。三期梅毒（晚期梅毒）实验室检查：

1非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。

2梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。

3脑脊液检查：白细胞计数≥10×106/L，蛋白量＞500mg/L，且无其他引起这些异常的原因。脑脊液VDRL试验（存在假阴性）或FTA-ABS试验（存在假阳性）阳性。

4组织病理检查：有三期梅毒的组织病理变化。诊断标准疑似病例：流行病学史、临床表现中的任一项和1项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和2、3、4中的任一项。隐性梅毒（潜伏梅毒）实验室检查：1非梅毒螺旋体抗原血清学试验：对于无既往梅毒史者，非梅毒螺旋体抗原试验阳性（滴度一般在1：8以上）。对于有既往梅毒治疗史者，与前次非梅毒螺旋体抗原试验结果相比，本次试验结果阳转或其滴度升高4倍或更高。2梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。3脑脊液检查：无异常发现。诊断标准疑似病例：应同时符合梅毒流行病学史、临床表现和1项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和2、3项。

胎传梅毒（先天梅毒）实验室检查：1暗视野显微镜检查：在早期胎传梅毒儿的皮肤黏膜损害或胎盘中可查到梅毒螺旋体。2非梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。2.1血清抗体滴度持续上升。2.2定量试验结果比母亲高四倍（低于或等于并不排除）3梅毒螺旋体抗原血清学试验：阳性。患儿检出19S－IgM抗体。诊断标准疑似病例：应同时符合梅毒流行病学史、临床表现和2项。确诊病例：应同时符合疑似病例的要求和1、3中的任一项。梅毒的传播途径：性接触是主要的传染途径母婴传播血源性传播间接接触传播梅毒实验室检测方法病原学检查血清学检测病原学检查－实验原理一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋结穿刺术得到的组织液；在暗视野显微镜下光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测；梅毒螺旋体的亲银特性；运用特异性的抗梅毒螺旋体与梅毒螺旋体发生抗原抗体反应的原理，将已经经过Reiter株非致病螺旋体制成的吸收剂吸收过标记有异硫氰酸盐荧光素（FITC）的抗梅毒螺旋体或单克隆抗体加到载有标本的玻片上，如标本上有梅毒螺旋体，则会出现抗原抗体反应，荧光显微镜下可查到翠绿色荧光标记的螺旋体。病原学检查－试验方法病原学检查的主要方法有暗视显微镜检查、镀银染色法和直接荧光法。病原学检查－取材

皮肤黏膜损害取材用棉拭子或纱布取无菌盐水轻轻擦去皮损上的污物，如皮损上有痂皮，可用钝刀小心除去，再用钝刀轻轻地刮数次（避免出血）；并挤压至产生血清渗出物。用薄刮片或接种环刮取渗出液，直接置于载玻片上，或直接用载玻片沾取渗出液。淋巴结取材消毒淋巴结表面皮肤，用无菌干棉球擦干。用1mL无菌注射器配12号针头，吸取无菌等渗盐水0.25mL～0.5mL，以无菌操作穿刺淋巴结并注入盐水，再吸入注射器内，反复2～3次后，取少量淋巴液于载玻片上。病原学检查－结果

暗视野显微镜下，典型的梅毒螺旋体呈白色发光,其螺旋较密而均匀，运动规律，运动性较强。梅毒螺旋体具有亲银性，镀银染色后显微镜下可见到染成棕色的梅毒螺旋体。直接荧光染色后，在荧光显微镜下可见到发苹果绿色的梅毒螺旋体。临床意义与暗视野显微镜检测相同。但DFA的特异性及敏感性均大于暗视野显微镜检测。病原学检查－临床意义病原学方法直接镜检到梅毒螺旋体，在临床可确诊梅毒，且具有快速、简便、直接的特点。螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最佳方法(一期、二期梅毒皮损或淋巴结节、孕妇羊膜穿刺)，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性，取材部位不正确、螺旋体数量不足、患者已接受抗生素治疗、损害接近自然消退和实验室工作人员缺乏经验等均会影响结果的判断。梅毒血清学检测非梅毒螺旋体抗原血清学试验（非特异性梅毒抗体）梅毒螺旋体抗原血清学试验（特异性梅毒抗体）非梅毒螺旋体抗原血清学试验－原理

梅毒螺旋体一旦感染人体，经过一段时间，宿主迅速对螺旋体表面的脂质作出免应答，在3周-4周产生抗类脂抗原的抗体（非特异性反应素），主要是IgM和IgG混合抗体。未经治疗的病人，其血清内的反应素可长期存在。经正规治疗后，反应素可以逐渐减少至转为阴性。所有非梅毒螺旋体抗原血清试验的抗原基本成分都是一样。非梅毒螺旋体抗原血清学试验－原理非梅毒螺旋体抗原试验是使用心磷脂、卵磷脂及胆固醇作为抗原的絮状凝集试验。反应素与心磷脂形成抗原抗体反应，卵磷脂可加强心磷脂的抗原性，胆固醇可增强抗原的敏感性。心磷脂、卵磷脂遇水形成胶体溶液，胆固醇遇水形成结晶。当抗原与抗体（反应素）混合发生反应时，后者即粘附胶体微粒的周围，形成疏水性薄膜。由于摇动、碰撞，使颗粒与颗粒互相粘附而形成肉眼可见的颗粒凝集和沉淀，即为阳性反应。如遇到非梅毒血清，因体液中的白蛋白多于球蛋白，而白蛋白对胶体颗粒有保护作用，形成亲水性薄膜，即使同样摇动、碰撞，由于抗原颗粒周围没有粘附免疫球蛋白的作用，不能形成较大颗粒，无肉眼可见的凝集和沉淀，因此为阴性反应。常见的非梅毒螺旋体抗原血清学试验：1、性病研究实验室试验(venerealdiseaseresearchlaboratorytest，VDRL)2、不加热血清反应素试验（unheatedserumreagintest，USR）3、快速血浆反应素环状卡片试验(rapidplasmareagincirclecardtest，RPR)4、甲苯胺红试验(tolulizedredunheatedserumtest，TRUST)性病研究实验室试验（VDRL)特点抗原需新鲜配制，不能长时间保存血清标本需56℃灭活目前主要用于脑脊液标本检查显微镜观察结果主要用于神经梅毒的脑脊液检查,特异性高，但敏感性低不加热血清反应素试验（USR）特点是VDRL试验的改良抗原同VDRL，但抗原可长期保存，能维持一年血清样本不必加热灭活制成试剂盒，使用方便快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）特点在USR试剂成分的基础上加入了黑色碳颗粒，作为沉淀的指示物，所不需要显微镜观察结果，可用肉眼直接观察特制的白色纸卡替代了玻片血清不需灭活可作定量试验有现成的试剂盒，携带方便操作简单价格便宜梅毒自动旋转仪梅毒自动旋转仪RPR质控卡RPR试验结果甲苯胺红试验（TRUST)特点TRUST试验原理与RPR试验原理相同。唯TRUST试验的抗原中加入甲苯胺红颗粒代替活性炭颗粒指示物，使阳性结果出现红色絮状现象，阴性结果见红色颗粒集于中央或均匀分散。TRUST试验结果TRUST试验与RPR试验结果非梅毒螺旋体抗原血清学试验－临床意义早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后3个月，VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度，6个月下降4个稀释度一期梅毒1年后转阴二期梅毒2年后转阴晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍然阳性非梅毒螺旋体抗原血清学试验－临床意义非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好，适合于大量人群的筛查、产前检查及健康体检等早期梅毒硬下疳出现1－2周后，血清可呈现阳性治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征非梅毒螺旋体抗原血清学试验－假阳性技术性假阳性反应由于标本保存不当（如细菌污染或溶血）、试剂质量差或过期、或实验室操作错误所造成生物学假阳性反应是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化，使梅毒血清学试验出现阳性梅毒假阳性的处理由操作错误引起的技术性假阳性反应，经过重复试验即可排除。对于急性生物学假阳性反应，应做TPPA/TPHA等试验进行排除前带现象指非梅毒螺旋体抗原血清试验中，有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性、不典型或阴性反应的结果，而临床上又象二期梅毒，此时将血清稀释后再进行试验，出现了阳性的结果，该现象称为前带现象耐血清性（血清固定）指经抗梅毒治疗后，非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不转阴。早期耐血清性常与治疗不足或不规则治疗、复发、再感染或有神经系统梅毒等因素有关影响定量试验稳定性的因素移液器、水平旋转仪、试剂滴管等要校准反应孔大小要标准标本稀释前生理盐水不涂开，稀释好的标本要求涂满整个反应板圆圈；涂布从稀释最高倍数开始，依次到原倍。旋转速度、时间要准确，结果观察要及时。非梅毒螺旋体抗原血清试验方法比较VDRLUSRRPRTRUST抗原成分心磷脂、卵磷脂、胆固醇同前+EDTA+氯化胆碱同前+EDTA+氯化胆碱+活性炭同前+EDTA+氯化胆碱+甲苯胺红抗原稳定性不稳定,1天稳定4℃～8℃保存12个月稳定4℃～8℃保存12个月稳定4℃～8℃保存12个月血清试验前处理需灭活不需灭活不需灭活不需灭活反应板直径14mm漆圈玻片直径14mm圆圈的一次性塑料（玻璃）直径为18mm圆圈的特制白色反应卡片直径为18mm圆圈的特制白色反应卡片针头60±1滴/mL45±1滴/ml60±1滴/mL60±1滴/mL转速180±5次/min180±5转/min100±5转/min100±5转/min转时4min4min8min8min显微镜10×10倍显微镜下观察肉眼或100倍显微镜肉眼肉眼梅毒螺旋体抗原血清学试验采用梅毒螺旋体特异蛋白作抗原，检测血清中抗梅毒螺旋体IgG或IgM抗体（为特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体），其敏感性和特异性均较高。感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。常见的梅毒螺旋体抗原血清学试验：1梅毒螺旋体血球凝集试验（treponemapallidumhaemagglutinationassay,TPHA）2梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验（treponemapallidumparticleassay，TPPA）3荧光螺旋体抗体吸收试验（fiuorescenttreponemalantibodyabsorptiontest，FTA-ABS）4梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）5梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）6梅毒免疫层析法－梅毒快速检测（RT）7测定螺旋体IgM抗体的血清学试验8化学发光免疫分析法（CLIA）TPPA/TPHA试验－报告方法a.阳性报告：定性试验，血清在1:80以上稀释度与致敏颗粒发生凝集反应（1+或更强），与未致敏颗粒（第3孔）不发生凝集反应。定量试验则应报告发生阳性反应的血清最高稀释度，为血清滴度。

b.阴性报告：血清与致敏颗粒和未致敏颗粒均不发生凝集反应。TPPA结果TPPA/TPHA试验－注意事项

a.微量反应板要清洁干净，孔内无异物。

b.加入血清后，使用微量板振荡器振荡反应板，而不可使用水平旋转仪。

c.试剂盒不可置于0℃以下，防止冻结。不同批号试剂不可混合使用。

d.有些血清标本在血清低稀释度时可出现前带现象，此时可作定量试验；

e.如未致敏颗粒出现凝集反应，应将血清进行吸收处理后再进行试验，或改用其他试验方法。TPPA试验TPPA/TPHA试验－血清吸收处理a.取0.95mL已恢复体积的未致敏颗粒加入清洁的小试管内。

b.试管内加入50μL血清标本并充分混匀，置15～25℃20min或更长时间。

c.离心2000rpm，5min，取25μL上清液（血清标本稀释1：20）置第3孔，注意不要混入颗粒。

d.自第4孔～第10孔各加25mLB液。

e.自第3孔吸25mL至第4孔，混匀后吸25mL至第5孔……如此稀释至第10孔，弃去25mL。

f.按定量试验法加入D液和C液，将反应板置微量板振荡器上振荡30秒钟，置湿盒内，15～25℃孵育2小时观察结果。荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)－原理FTA-ABS试验以完整形态的Nichol梅毒螺旋体作为抗原，加上经吸收剂（用Reiter株螺旋体制备而成）处理过的患者血清形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白，与血清梅毒螺旋体抗体结合。在荧光显微镜下，螺旋体显示苹果绿色的荧光，即为阳性反应。FTA-ABS－材料a.梅毒螺旋体抗原玻片，有直径0.5cm涂布梅毒螺旋体的圆圈，在高倍镜下每视野不少于30条螺旋体，丙酮固定。

b.吸收剂（5