基因敲除新技术

ZFN技术原理锌指核酸酶（Zinc-fingernucleases,ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别3-4个碱基；人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列；构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。ZFN技术锌指核酸酶介导的定向染色体删除研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。崭新的技术-TALEN经典的挑战–染色体DNA序列的人工编辑修改（点）突变：Silent；Missense；Nonsense；Frameshift（基因敲除，Knockout）片段删除片段插入目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗崭新的技术解决经典的挑战靶向基因技术经典方法：自杀质粒，同源重组–几率低(~1HReventper106cells），难！饱含希望与失望的技术：ZFN，被Sigma公司垄断新的里程碑：TALENTALEN技术基于TALEN(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)的靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大鼠等各类研究对象。技术原理：表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。1989年植物病原体黄单胞菌属（Xanthomonasspp.）avrBs3基因被克隆。2007年发现其序列特异性核酸结合特性，avrBs3–TA2009年XanthomonasTA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译由34个aa组成一个单元模块，重复17-18次34个aa中的第12和13个氨基酸（RepeatVariantDi-residue,RVD)对应识别一个目标碱基

TALEN发展过程人工构建TALE模块识别指定核酸序列102碱基模块单元……14–18个重复真核表达……14–18个重复特异识别指定的14-18个核酸序列并与之结合34氨基酸单元TALEN发展过程TALEN(TALE+FOKI)表达质粒对TALEN基因敲除X2TALEN表达质粒对转染、表达切割靶位点切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体TALEN介导的同源重组同源重组发生率升高几个数量级DonorplasmidHRDonorplasmidLeftarmRightarmDonorplasmidLeftarmRightarm点突变片段删除基因敲入2011年8月，NatureBiotechnology上同时发表了用TALEN技术进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。一篇人类干细胞《GeneticengineeringofhumanpluripotentcellsusingTALEnucleases》

一篇大鼠《KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs》

两篇斑马鱼《TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs》《HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs》

一篇综述《MoveoverZFN》TALEN的最前沿TALEN靶向（基因敲除）技术

基本流程选择、确定靶点2.TALE识别模块串联构建3.TALEN真核表达质粒构建4.TALEN真核表达质粒转入（卵）细胞，表达TALEN重组蛋白5.检测突变效率，筛选（移码）突变体X2X2X2靶点的DNA序列特征：相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点参考文献：Cermaketal.,EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting,NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12,e82.在线靶点选择设计软件：/node/add/talef-off/选择确定TALE靶点

TAL的核酸识别单元为34aa模块中的双连氨基酸（RVD）

RVD与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G，非常简单明确欲使TALEN特异识别某一核酸序列（靶点），只须按照靶点序列将相应TAL单元（14-18个）串联克隆即可。TALE识别模块串联构建具专利保护的克隆构建系统具专利保护的克隆构建系统步骤一：靶点识别单元串联步骤二：TALEN表达质粒构建具专利保护的克隆构建系统将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14-18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。X2真核表达TALEN质粒对步骤三.将TALEN质粒对共转入细胞中实现靶基因敲除TALEN质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALEN融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。FOKI内切酶打断靶点区内切酶的切割诱发DNA损伤修复机制（nonhomologousend-joining，NHEJ）。由于在此修过程中总是有一定的错误率存在。在修复中发生移码突变错误的个体即形成目标基因敲除突变体。突变体形成PCR–酶切法利用靶点设计时挑选的，位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，进行PCR产物酶切鉴定。当左右靶点之间没有合适的酶切位点时可使用CEL-I核酸酶检测。经验规律：>=2%可用，>=10%很好TALEN切割效率检测TALEN切割效率检测启动子–ABCDEF–stop-Target

site-DEFHIJK启动子–ABCDEFHIJK共转染荧光素酶检测质粒+TALEN质粒1+TALEN质粒2荧光素酶检测法发光倍数与切割效率之间的定量关系尚缺乏充分研究。有文献表明，发光倍数达1.5至2倍即可有效获得突变体。突变体筛选

有限稀释法获得单细胞克隆

PCR-酶切法鉴定

PCR测序确认基本工具质粒14–18bp靶点序列怎样做TALEN1单元模块质粒：A，G，C,T共4种2单元模块质粒：4X4=16种TALEN表达载体：基于PCS2质粒2种怎样做TALEN怎样做TALENTALEN技术成功率影响因素重组TALEN模块与靶位点的‘亲合力’靶点序列设计原则来自20个天然TLAE的统计规律细胞系固有特性K562容易，293中等，MC-10困难细胞转染效率不同细胞系转染效率不同，293高，HeLa低所期待的目标Heterozygous？Homozygous？Exactpointmutation？Selectionmarkerinsertion？TALE技术应用范围细菌：尚无报道，已另有多种高效靶向技术。真菌：有报道，TALE原理可行。植物：TALE原理发现于植物，需特定转基因技术。动物细胞：TALE原理可行，各细胞系效率不一。斑马鱼：有TALEN基因敲除报道，尚无点突变与敲入报道。小鼠、大鼠……原理肯定可行，但尚无报道（技术太新，转基因动物构建实验周期较长）。TALEN应用扩展的技术关键：切实可靠的表达系统。高效的转基因及克隆筛选技术。TALEN的植物应用TingLiet.al.High-efficiencyTALEN-basedgeneeditingproducesdiseaseresistantrice，

volume30number5may2012NatureBiotechnology

背景水稻病原菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)导致细菌性白叶枯病。细菌天然TALEAvrXa7orPthXo3与水稻Os11N3基因启动子结合，调控（hijack）此基因上调表达，促进细胞内糖份向细胞外转运，便于病原菌利用。策略以TALEN对细菌TALE靶点区做突变，使细菌TALE无法与水稻Os11N3基因启动子结合。

结果突变水稻获得抵御细菌感染的能力TALEN与主要类同技术比较siRNA优于TALEN可瞬时转染快速观察效果Knockdown效果确实，可用于必须基因逊于TALEN瞬时转染效果短暂不是彻底knockout慢病毒稳转发生染色体随机整合ZFN优于TALEN经验积累多，技术较成熟逊于TALEN技术复杂，难度高，被Sigma公司垄断靶点序列要求高，难找Off-targeting现象严重经常有显著细胞毒性基因组精密工程

今年来自梅奥医学中心的研究人员第一次利用人工酶切割一段基因序列中的部分DNA，并用合成DNA取代它们，对斑马鱼基因组部分序列进行了定制修改。这种技术称为转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TALENs）方法，相比ZFNs和morpholinos，TALENs具有几个优势：它们更便宜、更有效，尤其是以一种开发活性形式应用时。ZFNs只能靶向特异序列，而TALENs有潜力对任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效应是短暂的，而TALENs可造成永久性的改变。随后科学家们在蟾蜍等其它动物中展开了这方面的研究，证明这种技术与已证实的基因靶向技术一样有效。国内清华大学的施一公和颜宁等人也于今年在Science杂志上报道了TALE特异识别DNA的分子机理，这提供了TALE蛋白的改造基础，极大地拓宽了TALE蛋白在生物技术应用上的前景。新技术介绍CRISPR-Cas系统基因修饰技术Biotechnology:RewritingagenomeNature

495,

50–51

(07March2013)

doi:10.1038/495050a1CRISPR-Cas概述1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。2013以后，研究者们在包括《science》和《naturebiotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。1CRISPR-Cas概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR-Cas主要由两部分组成：识别切割1CRISPR-Cas概述1.1CRISPR结构CRISPR：（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）

CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细