第九章 核糖体(ribosome)

第九章核糖体RIBOSOME第九章核糖体(ribosome)

核糖体是合成蛋白质的细胞器；

核糖体几乎存在于一切细胞内，不论是原核细胞还是真核细胞。

核糖体的类型与结构

多聚核糖体与蛋白质的合成

反义RNA与核酶第一节核糖体的类型与结构

核糖体是合成蛋白质的细胞器，其唯一的功能是按照mRNA的指令由氨基酸高效且精确地合成多肽链。

核糖体的基本类型与成分

核糖体的结构

核糖体蛋白质与rRNA的功能分析

一、核糖体的基本类型与成分

核糖核蛋白体,简称核糖体(ribosome)

基本类型

附着核糖体

游离核糖体

70S的核糖体

80S的核糖体

主要成分

r蛋白质：40%，核糖体表面

rRNA:60%,，核糖体内部

发现核糖体的两个关键技术二、核糖体的结构

结构与功能的分析方法

蛋白质合成过程中很多重要步骤与50S核糖体大亚单位相关

结构与功能的分析方法

离子交换树脂可分离纯化各种r蛋白；

纯化的r蛋白与纯化的rRNA进行核糖体的重组装，显示核糖体中r蛋白与rRNA的结构关系

双向电泳技术可显示出E.coli核糖体在装配各阶段中，与rRNA结合的蛋白质的类型

双功能的交联剂和双向电泳分离可用于研究r蛋白在结构上的相互关系

电镜负染色与免疫标记技术结合，研究r蛋白在核糖体的亚单位上的定位。

对rRNA，特别是对16SrRNA结构的研究

70S核糖体的小亚单位中rRNA与全部的r蛋白关系的空间模型

同一生物中不同种类的r蛋白的一级结构均不相同，在免疫学上几乎没有同源性。

不同生物同一种类r蛋白之间具有很高的同源性，并在进化上非常保守。

蛋白质结合到rRNA上具有先后层次性。

核糖体的重组装是自我装配过程

二十世纪六十年代初期RobertPerry用紫外微光束破坏活细胞的核仁，发现破坏了核仁的细胞丧失合成rRNA的能力，这一发现提示核仁与核糖体的形成有关。后来Perry又发现低浓度的放线菌素D能够抑制3H-尿嘧啶掺入rRNA中，而不影响其他种类的RNA合成。显微放射自显影也显示放线菌素D能够选择性阻止核仁RNA的合成，表明核仁与rRNA的合成有关。

16SrRNA的一级结构是非常保守的

16SrRNA的二级结构具有更高的保守性：

臂环结构(stem-loopstructure)

rRNA臂环结构的三级结构模型蛋白质合成过程中很多重

要步骤与50S核糖体大亚单位相关

涉及的多数因子为G蛋白(具有GTPase活性)，核糖体上与之相关位点称为GTPase相关位点。

最近人们成功地制备L11-rRNA复合物的晶体，获得了其空间结构高分辨率的三维图象。

这一结果证实了前人用各种实验技术所获得的种种结论提出直观、可靠且比人们的预料更为精巧复杂和可能的作用机制，从而为揭开核糖体这一具有30多亿年历史的古老的高度复杂的分子机器的运转奥秘迈出了极重要的一步。三、核糖体蛋白质与rRNA的功能分析

核糖体上具有一系列与蛋白质合成有关的结合位点与催化位点

在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究

核糖体上具有一系列与蛋白质

合成有关的结合位点与催化位点

与mRNA的结合位点

与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点——氨酰基位点，又称A位点

与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点——肽酰基位点，又称P位点

肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点——E位点(exitsite)

与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G)的结合位点

肽酰转移酶的催化位点

与蛋白质合成有关的其它起始因子、延伸因子和终止因子的结合位点核糖体上具有一系列与蛋白质

合成有关的结合位点与催化位点

与mRNA的结合位点

与新掺入的氨酰-tRNA的结合位点——氨酰基位点，又称A位点

与延伸中的肽酰-tRNA的结合位点——肽酰基位点，又称P位点

肽酰转移后与即将释放的tRNA的结合位点——E位点(exitsite)

与肽酰tRNA从A位点转移到P位点有关的转移酶(即延伸因子EF-G)的结合位点

肽酰转移酶的催化位点

与蛋白质合成有关的其它起始因子、延伸因子和终止因子的结合位点

在蛋白质合成中肽酰转移酶的活性研究

核糖体蛋白

在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分

r蛋白质的主要功能核糖体蛋白

很难确定哪一种蛋白具有催化功能：在E.coli中核糖体蛋白突变甚至缺失对蛋白质合成并没有表现出“全”或“无”的影响。

多数抗蛋白质合成抑制剂的突变株，并非由于r蛋白的基因突变而往往是rRNA基因突变。

在整个进化过程中rRNA的结构比核糖体蛋白的结构具有更高的保守性。在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分

具有肽酰转移酶的活性；

为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点)；

为多种蛋白质合成因子提供结合位点；

在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结合以及在肽链的延伸中与mRNA结合；

核糖体大小亚单位的结合、校正阅读(proofreading)、无意义链或框架漂移的校正、以及抗菌素的作用等都与rRNA有关。r蛋白质的主要功能

对rRNA折叠成有功能的三维结构是十分重要的；

在蛋白质合成中,某些r蛋白可能对核糖体的构象起“微调”作用；

在核糖体的结合位点上甚至可能在催化作用中,核糖体蛋白与rRNA共同行使功能。第二节聚核糖体与蛋白质的合成

多聚核糖体(polyribosome或polysome)

蛋白质的合成

蛋白质合成的起始(initiation)、多肽链的延伸(elongation)、终止(termination)

RNA在生命起源中的地位及其演化过程

一、多聚核糖体(polyribosome或polysome)

概念核糖体在细胞内并不是单个独立地执行功能，而是由多个甚至几十个核糖体串连在一条mRNA分子上高效地进行肽链的合成，这种具有特殊功能与形态结构的核糖体与mRNA的聚合体称为多聚核糖体。

多聚核糖体的生物学意义

细胞内各种多肽的合成，不论其分子量的大小或是mRNA的长短如何，单位时间内所合成的多肽分子数目都大体相等。

以多聚核糖体的形式进行多肽合成，对mRNA 的利用及对其浓度的调控更为经济和有效。三、RNA在生命起源中的地位及其演化过程

生命是自我复制的体系

DNA代替了RNA的遗传信息功能

蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能

生命是自我复制的体系

三种生物大分子，只有RNA既具有信息载体功能又具有酶的催化功能。因此，推测RNA可能是生命起源中最早的生物大分子。

核酶(ribosome)：具有催化作用的RNA。

由RNA催化产生了蛋白质DNA代替了RNA的遗传信息功能

DNA双链比RNA单链稳定；

DNA链中胸腺嘧啶代替了RNA链中的尿嘧啶，使之易于修复。蛋白质取代了绝大部分RNA酶的功能

蛋白质化学结构的多样性与构象的多变性；

与RNA相比，蛋白质能更为有效地催化多种生化反应，并提供更为复杂的细胞结构成分，逐渐演化成今天的细胞。核糖体的类型●按存在的部位:有三种类型核糖体，细胞质核糖体、线粒体核糖体、叶绿体核糖体。●按存在的生物类型:分为两种类型，即真核生物核糖体和原核生物核糖体。原核细胞的核糖体较小，沉降系数为70S，相对分子质量为2.5x103kDa，由50S和30S两个亚基组成；而真核细胞的核糖体体积较大，沉降系数是80S，相对分子质量为3.9～4.5x103kDa，由60S和40S两个亚基组成。从两个不同角度观察的E.coli核糖体的三维结构Mg2+的浓度对于大小亚基的聚合和解离有很大的影响，体外实验表明:70S核糖体在Mg2+的浓度小于1mmol/L的溶液中易解离；当Mg2+浓度大于10mmol/L，两个核糖体通常形成100S的二聚体；在低浓度的Mg2时，完整的核糖体将分成大小两个亚基。不同类型核糖体的大小比较来源完整核糖体核糖体亚基核糖体RNAs细胞质80S60S(大亚基)28S，5.8S，5S(真核生物)

40S(小亚基)18S，细胞质70S50S(大亚基)23S，5S(原核生物)

30S(小亚基)16S线粒体55-60S45S(大亚基)16S(哺乳动物)

35S(小亚基)12S线粒体75S53S(大亚基)21S(酵母)

35S(小亚基)14S线粒体78S60S(大亚基)26S，5S(高等植物)

45S(小亚基)18S叶绿体70S50S(大亚基)23S，5S

30S(小亚基)16S原核生物与真核生物核糖体成分的比较

典型的原核细胞和真核细胞质核糖体的化学组成发现核糖体及核糖体功能鉴定的两个关键技术核糖体最早是AlbertClaude于1930s后期用暗视野显微镜观察细胞的匀浆物时发现的，当时称为微体(Microsomes)，直到1950s中期，GeorgePalade在电子显微镜下观察到这种颗粒的存在。并进一步研究发现多种生物的细胞质中有类似的颗粒存在，尤其在进行蛋白质合成的细胞中特别多；PhilipSiekevitz用亚细胞组份分离技术分离了这种颗粒，并发现这些颗粒总是伴随内质网微粒体一起沉积。化学分析揭示，这种微粒富含核苷酸，随之命名为ribosome，主要成分是核糖体RNA(rRNA)，约占60%、蛋白质(r蛋白质)约占40%。核糖体的蛋白质合成功能是通过放射性标记实验发现的。将细胞与放射性标记的氨基酸短暂接触后进行匀浆，然后分级分离，发现在微粒体部分有大量新合成的放射性标记的蛋白质。后将微粒体部分进一步分离，得到核糖体和膜微粒，这一实验结果表明核糖体与蛋白质合成有关。两个关键技术是亚细胞组份分离技术和放射性标记技术。E.coli核糖体小亚单位中rRNA与r蛋白的相互关系示意图线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线）（引自Albertsetal，1989）核糖体蛋白通过电泳和层析等技术，已经鉴定了E.coli核糖体小亚基的21种蛋白质和大亚基的34种蛋白质。小亚基的蛋白分别命名为S1～S21，大亚基的核糖体蛋白命名为L1～L33。核糖体中的蛋白质除了一种具有四个拷贝外，其余都是一个拷贝。图示为E.coli小亚基21种蛋白质的排列。E.coli核糖体结构模型E.coli小亚基的装配图粗箭头表示结合力强，细箭头表示力弱。如S4与16SrRNA之间是粗箭头，表示S4可直接与16SrRNA结合而不需要其他蛋白的存在。而S7与16SrRNA的结合力很弱，并且需要S4、S8、S9、S19、S20蛋白的存在。自组装(self-assembly):1968年，MasayasuNomura把拆开的大肠杆菌核糖体的30S小亚基的21种蛋白质与16SrRNA在体外混合后重新装配成30S小亚基，然后把重建的小亚基同50S大亚基以及其他辅助因子混合后，进行蛋白质合成实验，发现重建的核糖体具有生物活性，能催化氨基酸掺入到蛋白质多肽链中。这一实验表明，核糖体是一种自组装(self-assembly)的结构，即没有样板或亲体结构所组成的结构。但是在组装过程中，某些蛋白质必须首先结合到rRNA上，其他蛋白才能组装上去，即组装过程有先后层次有人用核糖体重组实验得到一些重要的结论：

30S亚基的蛋白质专同16SrRNA结合;50S亚基的蛋白质只同23SrRNA结合，如果把30S亚基rRNA和50S亚基的蛋白质相混合，则不能装配成有功能的亚基。

从不同种细菌提取30S亚基的rRNA和蛋白质，可装配成有功能的30S亚基，这表明不存在种间差异。

原核生物核糖体与真核生物核糖体的亚基彼此不同，由二者的rRNA和蛋白质重组后的核糖体没有功能。

大肠杆菌的核糖体与玉米叶绿体核糖体亚基重组后具有功能。

由于不同生物的线粒体核糖体大小不同，由55S到80S不等，而原核生物的核糖体基本稳定，所以线粒体的核糖体亚基同原核生物核糖体亚基相互交换形成的杂合核糖体没有功能。E.coli（a）核糖体小亚单位中的部分r蛋白与rRNA的结合位点）（b）及其在小亚单位上的部位（引自Albertetal.，1989，图a;Lewin,1997,图b）核糖体小亚单位rRNA的二级结构(a)E.coli16SrRNA；（红色为高度保守区）(b)酵母菌18SrRNA，它们都具有类似的40个臂环结构(图中1～40)，其长度和位置往往非常保守；P、E分别代表仅在原核或真核细胞中存在的rRNA的二级结构。(Darnelletal.，1990)核糖体rRNAHarryHoller测定了E.coli16SrRNA序列，一共有1542个核苷酸。通过计算机分析，发现不同生物来源的16SrRNA的序列组成具有进化上的保守性。推测16SrRNA结构有四个结构域，每个结构域都有46%的碱基配对，形成螺旋的柄状结构。每一个柄状结构都很短，不到8bp，且并不都是完全配对的。16SrRNA的电子显微照片的形态与30S核糖体亚基相似，因此认为30S核糖体亚基的形态主要是由16SrRNA决定的。折叠主要是由序列中互补碱基配对引起的SD序列(SDsequence)典型的细菌核糖体与mRNA的结合位点，mRNA中的SD序列与核糖体16SrRNA3'端互补。在SD序列的下游5～10个碱基处是起始密码AUG或GUG。在原核生物中,核糖体中与mRNA结合位点位于16SrRNA

的3＇端,mRNA中与核糖体16SrRNA结合的序列称为SD序列(SDsequence),它是1974年由J.Shine

和L.Dalgarno发现的,故此而命名。SD序列是mRNA中5＇端富含嘌呤的短核苷酸序列,一般位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10个碱基处,并且同16SrRNA3＇端的序列互补。L11-rRNA复合物的三维结构(引自Porseet.al.,1999)在蛋白质合成过程中，同一条mRNA分子能够同多个核糖体结合，同时合成若干条蛋白质多肽链，结合在同一条mRNA上的核糖体就称为多聚核糖体(polysome

或polyribosomes),图中所示是蚕的丝心蛋白mRNA3‘端多聚核糖体，箭头所示是丝心蛋白多肽；多聚核糖体形成的意义何在:同一条mRNA被多个核糖体同时翻译成蛋白质，大大提高了蛋白质合成的速率，更重要的是减轻了细胞核的负荷，减少了基因的拷贝数，也也减轻了细胞核进行基因转录和加工的压力。多聚核糖体的形成在mRNA的起始密码子部位，核糖体亚基装配成完整的起始复合物，然后向mRNA的3＇端移动，直到到达终止密码子处。当第一个核糖体离开起始密码子后，空出的起始密码子的位置足够与另一个核糖体结合时，第二个核糖体的小亚基就会结合上来，并装配成完整的起始复合物，开始蛋白质的合成。同样，第三个核糖体、第四个核糖体、……依次结合到mRNA上。根据电子显微照片推算，多聚核糖体中，每个核糖体间相隔约80个核苷酸。A位点(Asite)即氨酰基位点，是与新掺入的氨酰tRNA(aminoacyl-tRNA)结合的位点,又叫受位(entrysite)，主要位于大亚基，是接受氨酰tRNA的部位；P位点(Psite)即肽酰tRNA位点(peptidyl-tRNAsite),又叫供位(donorsite),或肽酰基位点,主要位于大亚基,是肽基tRNA移交肽链后肽酰tRNA所占据的位置,即与延伸中的肽酰tRNA结合位点；E位点(exitsite,Esite)

E位点是脱氨酰tRNA(deaminoacyl-tRNA)离开A位点到完全从核糖体释放出来的一个中间停靠点,只是作暂时的停留。当E位点被占据之后,A位点同氨酰tRNA的亲和力降低,防止了氨酰tRNA的结合,直到核糖体准备就绪,E位点腾空,才会接受下一个氨酰tRNA。如何根据嘌呤霉素实验的结果判断核糖体中的A、P是两个分开的独立位点:在第一组实验中，只有起始tRNA占据P位，如果A位点是一个独立位点的话，此时的A位点就是空闲的，嘌呤霉素当然能够结合上去，如果A位点与P位点是同一位点，那么嘌呤霉素就不能与核糖体结合，实验结果是嘌呤霉素能够结合；在第二组实验中，由于A位点已经被二肽酰tRNA占据，所以嘌呤霉素无法与A位点结合，只有加入延伸因子和GTP后，使A位点腾空，嘌呤霉素才能结合到核糖体上。因此两根据这两组实验结果可以断定A、P是两个独立的功能位点。