开达膜原法、清热凉血法对急性肺损伤小鼠nf-bp50表达的影响

开达膜原法、清热凉血法对急性肺损伤小鼠nf-bp50表达的影响

急性肺损伤（ali）和急性呼吸急促综合征（arsd）是指除心脏源以外的各种内部和外部因素引起的急性和周期性缺如呼吸困难和严重感染、伤口和休克后的缺氧缺血性肺损伤综合征。实质是全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)在肺部的表现。急性肺损伤包括肺内上皮和肺泡的损害。NF-κB的活化在SIRS的发生发展中起了重要的作用,各种创伤、毒性物质、休克等诱因都能激活肺巨噬细胞和肺组织中的NF-κB,从而引起炎症介质的释放增高,而出现全身炎症反应综合征中肺部急性损伤。本实验研究通过采用小鼠尾静脉注射LPS(10mg/kg)建立小鼠急性肺损伤动物模型,观察模型对照组与开达膜原组、清热解毒组及清热凉血组核转录因子(NF-κBp50)水平的变化情况,以探讨中医不同治法在干预急性肺损伤的机制。1材料和方法1.1实验动物清洁级昆明种雄性小鼠70只,体重(20±2)g,由上海中医药大学实验动物中心提供(动物合格证号:SCXK(沪)2003-0003)。1.3急性肺损伤模型建立清洁级昆明种雄性小鼠70只,体重(20±2)g。随机分为正常对照组、模型对照组、开达膜原组、清热解毒组、清热凉血组5组,每组14只,再随机分为8h、24h两个亚组(每组7只)。模型对照组、清热解毒组、清热凉血组及开达膜原组经尾静脉注射LPS(10mg/kg)复制内毒素性急性肺损伤模型,正常对照组注入等容积生理盐水。开达膜原组、清热解毒组、清热凉血组于注射LPS(10mg/kg)后30min内灌开达膜原方、清热解毒方及清热凉血方药液各1次,各灌胃量按人与小鼠体表面积换算。正常对照组及模型对照组于相应时间灌服等容积生理盐水。注射LPS后8h(8h组),颈椎脱臼致死小鼠,开胸取出肺脏(称重),置于10%的甲醛中固定,行免疫组化染色,封片,显微镜观察。另一组注射LPS后24h(24h组),颈椎脱臼致死小鼠,开胸取出肺脏置于10%的福尔马林液中,常规脱水、封蜡。1.4观察指标和测试方法1.4.2图像分析检测免疫组化ABC法。采用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件进行图像分析。每张切片在高倍镜下随机选择不相重叠的3个视野,细胞核为蓝色,NF-κBp50阳性细胞为棕黄色。计数视野中总细胞数和阳性细胞数,计算阳性细胞所占百分率。1.5系统处理方法实验所得计量数据以表示,统计学方法采用SPSS11.0软件系统处理。各组组间进行两两对比,先用方差齐性分析;若为方差齐性则用两独立样本t检验,若为方差不齐,则用t检验。P<0.05或P<0.01为差异有显著性。2结果2.1小鼠肺体指数比较与正常对照组相比,造模后8h,模型对照组小鼠肺体指数明显升高(P<0.05);与模型对照组相比,清热解毒组小鼠肺体指数明显降低(P<0.05)。见表1。2.2不同途径感染nf-bp50表达,正常对照组肺组织结构正常,肺泡壁上偶见散在分布的NF-κBp50阳性细胞(见封三图1)。模型对照组肺泡壁明显增宽,可见炎症细胞大量增生,肺泡壁和细支气管壁散在分布大量NF-κBp50阳性细胞(见封三图2)。清热解毒方组可见局灶性病灶,肺泡壁和肺泡腔散在分布NF-κBp50阳性细胞(见封三图3)。清热凉血方组肺泡腔水肿明显减轻,NF-κBp50阳性细胞散在分布于肺泡壁和肺泡腔(见封三图4)。开达膜原方组炎症细胞消退明显,肺泡腔内无水肿液,散在分布的NF-κBp50阳性细胞(见封三图5)。与正常对照组相比,模型对照组NF-κBp50阳性细胞率升高(P<0.01),开达膜原方组、清热解毒方组及清热凉血方组NF-κBp50阳性细胞率均降低(P<0.05或P<0.01),各中药组之间阳性细胞率无明显差异。见表2。2.3小灶性肺出血灶模型光镜观察,正常对照组小鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺泡内未见水肿液,偶见肺间质白细胞少量增加(见封三图6);模型对照组肺组织呈大片出血、坏死,大量炎细胞浸润(见封三图7);清热解毒组局部肺组织中仍见小出血灶,肺组织结构未被破坏,局部细支气管上皮细胞增生(轻度)(见封三图8);清热凉血组肺组织见一处小灶性肺出血灶(见封三图9);开达膜原组见轻度肺间质炎症(见封三图10)。3急性肺损伤和肺局部炎症反应近年来,尽管对危重医学的研究取得了很大进展,但ALI/ARDS的病死率仍然高达30%~50%。有研究认为,糖皮质激素、阿斯匹林、抗氧化剂、抗炎细胞因子、一氧化氮等治疗急性肺损伤都有不同程度的抑制NF-κB的活化作用,但同时具有毒副反应。因此,采用中医不同治法干预急性肺损伤为临床治疗提示了一个新的思路。核转录因子(NF-κB)是与B细胞免疫球蛋白的轻链基因增强子序列结合的核转录因子。NF-κB存在于哺乳动物的所有细胞中,参与了感染、炎症免疫反应等病理过程。NF-κB活化还参与机体免疫和防御反应,及细胞周期调控与细胞分化的控制。正常细胞在静息状态下,NF-κB与其抑制因子相结合,并以无活性的形式存在于细胞质内。在炎症情况下,炎症介质中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可激活NF-κB,与细胞分裂有关的因素如抗原、植物血凝素、刀豆素A、细菌脂多糖、放射线等也可促进NF-κB的活化。NF-κB的活化对急性肺损伤有着重要意义。NF-κB的持续活化是急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征高病死率的预兆。抑制NF-κB的活化可减轻炎症反应,从而减轻急性肺损伤。王建春等研究表明,在脂多糖(LPS)复制的急性肺损伤模型中,大鼠肺组织中NF-κB被激活的同时,伴有TNF-αmRNA表达增高,且这些mRNA表达是受到NF-κB控制的。Schwart等发现ARDS患者的肺泡巨噬细胞的NF-κB激活水平明显高于对照组。可见,NF-κB的激活与急性肺损伤时肺局部炎症免疫反应密切相关。中医学认为,急性肺损伤属温病中的危重证。常见症状是气喘、呼吸急促、脉躁急。其病因与温邪蕴肺有关。《温病条辨》曰:“热病已得汗,脉尚躁而喘,故知其复热也;热不为汗衰,火热克金故喘。金受火克,肺之化源欲绝,故死。”其化源欲绝既是呼吸衰竭的中医机制,又是其症状的描述。吴鞠通在《温病条辨》中又曰:“细按温病死状百端……在上焦有二,一曰肺之化源绝者死,二曰心神内闭,内闭外脱者死。”说明肺之化源绝是危重证。其病理机制与温邪迫血、毒瘀互结,肺气膹郁有关。《温病条辨》又曰:“不得太息,气郁之极也,”“温邪逼迫血液上走清道,循清窍而出……实血与液交迫而出,有燎原之势,化源速绝”,“化源绝,乃温病第一死法也。”归纳而言,中医认为其产生机制是温邪上受,郁而化热,热毒伤阴,热毒煎熬致瘀,毒瘀互结;也可由湿热内蕴化毒,热入营血而致。根据中医病机,临床分型多见邪热化毒型、热伤营血型、湿热疫毒邪入膜原型等。治疗多采用清热解毒、清热凉血、开达膜原等法。现代药理研究表明:清热解毒方中黄芩能显著改善内毒素致大鼠DIC时血小板、纤维蛋白原的减少,还能影响花生四烯酸代谢,从而抑制内毒素所致发热反应。清热凉血方中赤芍药具有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗凝血、激活纤溶等作用,还具有显著的抗病原微生物作用。开达膜原方中厚朴煎剂(1∶5至1∶320)的抗菌作用较黄连、黄芩及大黄都强,且抗菌作用不因加热而被破坏。实验结果表明,与模型对照组比较,开达膜原组、清热解毒组及清热凉血组肺组织病理损伤均减轻,且各组肺组织NF-κBp50阳性细胞率均降低(P<0.05-0.01),提示开达膜原方、清热解毒方及清热凉血方对内毒素致急性肺损伤有保护作用,其机制可能与其调控NF-κBp50阳性细胞表达率有关。1.2成分分析LPS,购自美国Sigma公司(LPS:EscherichiacoliO55:B5,noL2880;批号:050307);NF-κBp50免疫组化试剂盒,购自美国SantaCruz公司[NF-κBp50(NLS):sc-114]。清热解毒方由黄连、黄芩、黄柏、栀子等6味中药按一定比例组成;清热凉血方由