辛硫磷对小鼠遗传毒性的研究

辛硫磷对小鼠遗传毒性的研究

有机磷农药是目前使用最大的农药。在控制病虫害的同时，它不可避免地会在农产品上留下残留。据报道,我国农产品中的农药残留污染严重,超标率远高于日本、美国等发达国家。辛硫磷(phoxim)化学名称为O,O-二乙基-O-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯,是一种高效、低毒、击倒力强、残留期短的广谱有机磷杀虫剂。随着甲胺磷等高毒有机磷农药逐渐被禁止使用,辛硫磷在农业生产中的使用量呈上升趋势,2005年就达到百万吨以上。据报道,辛硫磷对雄性哺乳动物具有生殖毒性,可造成大鼠精子数量减少、活动度降低,畸形率升高。而关于其对哺乳类动物遗传毒性的报道较为少见。因此,本研究首次采用单细胞凝胶电泳试验与小鼠骨髓细胞微核试验相结合的方法,评价辛硫磷对小鼠的遗传毒性,为揭示有机磷农药的毒性作用机制提供理论基础。1材料和方法1.1rad650型酶标仪DYCP-31E型水平电泳仪(北京六一仪器厂),E200型荧光显微镜(日本尼康公司),BioRad680型酶标仪(美国伯乐公司)。辛硫磷(40%乳油,山东东泰农化有限公司),琼脂糖、肝素钠、台盼蓝(0.04%)、溴化乙啶(EB,1μg/ml)均购自美国Sigma公司,Tris(台湾生工有限公司)。1.2动物分组及分组选择健康SPF级昆明小鼠60只,体重在20~24g之间,雌雄各半,购自新乡医学院动物实验中心,动物合格证号为2010-007。实验室温度为(25±2)℃,相对湿度为50%~55%,明暗比为12h∶12h。试验期间,动物可自由摄食、饮水。适应性饲养7d后,以辛硫磷对小鼠半数致死剂量(LD50)为依据,在预试验的基础上,将小鼠随机分为6组,分别为阴性对照(生理盐水)组和10、20、40、80mg/kg辛硫磷染毒组以及阳性对照组,每组10只,雌雄各半。采用灌胃方式进行染毒,染毒容量为10ml/kg,每日1次,连续染毒14d;而阳性对照组采用腹腔注射方式给予环磷酰胺(40mg/kg),每日1次,连续2d。染毒过程中,定期测量并记录小鼠体重。1.3微核试验方法染毒结束后,将小鼠脱颈椎处死,取下小鼠两侧股骨,参照史志诚等的方法进行微核试验。每只小鼠观察1500个细胞,计数含微核的细胞数,并计算微核率(微核率=微核细胞数/细胞总数×1000‰)。1.4细胞活力及细胞拖尾率取外周血约0.2ml,加入等量Hanks液充分混匀,将外周血混合液用滴管沿管壁缓慢加入预先加有0.2ml淋巴细胞分离液的1ml离心管中,离心后,用毛细管插到云雾层,吸取淋巴细胞,用适量PBS将淋巴细胞浓度调整到104~105/ml。采用MTT试验观察细胞的存活情况,细胞的存活率在95%以上。参照1988年Singh等的方法进行单细胞凝胶电泳试验。电泳后,经EB染色,用荧光显微镜(波长为515~560nm)观察。每件样本随机观察40个细胞图像,每组观察10件样本,即每组观察400个细胞,对DNA损伤的程度进行分级,分级标准为:无损伤(0级)、轻度损伤(1级)、中度损伤(2级)、重度损伤(3级)、完全损伤(4级)。参照赵影的方法,计算细胞拖尾率(细胞拖尾率=出现拖尾细胞数/细胞总数×100%)和DNA损伤专用单位。DNA损伤专用单位是一种衡量DNA链损伤程度的特有单位,是将不同的分级加以换算统计,得到DNA损伤的总体水平。其计算方法:DNA损伤专用单位=(0×0级细胞数+1×1级细胞数+2×2级细胞数+3×3级细胞数+4×4级细胞数)/细胞总数。2结果2.1大鼠体重测量的结果表1、2可见,各辛硫磷染毒组雄性、雌性小鼠体重与阴性对照组相比,差异均无统计学意义。2.2辛硫磷对小鼠骨髓细胞微核形成的影响辛硫磷对雄性和雌性小鼠的微核诱导作用表现出一致性。辛硫磷染毒小鼠骨髓细胞微核率的变化见表3。表3可见,与阴性对照组比较,10和20mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率略有升高,但差异均没有统计学意义;40和80mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着辛硫磷染毒剂量的升高,小鼠的骨髓细胞微核率均呈上升趋势。说明辛硫磷对小鼠骨髓细胞微核发生具有诱导作用。辛硫磷染毒小鼠骨髓微核细胞病理图见封三图1。阴性对照组小鼠骨髓细胞核为圆形;辛硫磷染毒后小鼠骨髓细胞形成的微核为圆形或椭圆形,大小在主核的1/5以下,微核的染色深度与主核一致或略浅于主核(封三图1)。2.3辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴细胞dna损伤的荧光显微镜辛硫磷对雄性和雌性小鼠的DNA损伤作用表现出一致性。辛硫磷染毒对雄性、雌性小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的变化分别见表4、5。表4、5可见,各剂量辛硫磷染毒组小鼠外周血淋巴细胞的拖尾率和DNA损伤专用单位均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。随着辛硫磷染毒剂量的升高,小鼠外周血淋巴细胞的拖尾率和DNA损伤专用单位均呈上升趋势。辛硫磷染毒小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤的病理图见封三图2。在荧光显微镜下,小鼠外周血淋巴细胞DNA被溴化乙啶染成橘红色。阴性对照组小鼠外周血淋巴细胞DNA呈现规则圆形的荧光头部(封三图2A),拖尾细胞以1级损伤(封三图2B)为主,且拖尾很短。10和20mg/kg辛硫磷染毒组拖尾细胞数显著增多,拖尾细胞以1级损伤(封三图2B)和2级损伤(封三图2C)为主,同时,还出现了3级损伤(封三图2D)和4级(封三图2E)损伤,表明小鼠外周血淋巴细胞受到的损伤较严重。40和80mg/kg辛硫磷染毒组拖尾细胞数进一步增多,拖尾细胞以1级损伤(封三图2B)、2级损伤(封三图2C)和3级损伤(封三图2D)为主,同时,4级损伤细胞增多(封三图2E),表明小鼠外周血淋巴细胞受到的损伤严重。3辛硫磷对小鼠骨髓细胞微核试验的影响我国生产的有机磷农药绝大多数是杀虫剂,在农业病虫害防治上起到了重要作用,但也不可避免地污染了周围环境。农民喷施农药中毒及人们食用近期喷施农药的蔬菜中毒事件时有报道,特别是谷物、水果、蔬菜中残留的低浓度农药对人体造成的潜在危害是不容忽视的。这些低浓度农药通过饮食进入人体之后,达到一定剂量时,就可能在分子水平造成DNA损伤或在细胞水平引起染色体畸变,而遗传物质的改变与致癌、致畸紧密相关。辛硫磷是一种高效低毒、广谱有机磷杀虫剂,目前应用于防治水稻、小麦、花生、玉米、棉花、蔬菜、果树、茶、桑等重要农作物的害虫,甚至用于防治仓库害虫、卫生害虫和渔业害虫,应用范围十分广泛。辛硫磷的使用量相对较大,其污染也较为严重。辛硫磷农药在环境中的残留是否会构成对人体健康的危害,一直是学术界关心的环境安全问题。有文献报道,辛硫磷可使细菌基因突变活力增强,并影响紫菜DNA、RNA和蛋白质合成。陈贤均等研究发现,高剂量辛硫磷可抑制小鼠骨髓细胞增殖,诱导小鼠骨髓细胞染色体结构畸变率增高,可见辛硫磷在基因和染色体水平均表现出一定的遗传毒性。推测辛硫磷可能导致某些遗传疾病和癌症的发生,具有遗传毒性。本研究首次采用单细胞凝胶电泳试验与小鼠骨髓细胞微核试验相结合的方法,评价了辛硫磷对小鼠的遗传毒性。骨髓细胞微核率试验结果显示,与阴性对照组比较,10和20mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率略有升高,但差异均没有统计学意义;40和80mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率显著性升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而单细胞凝胶电泳试验结果显示,与阴性对照组比较,各剂量辛硫磷染毒组小鼠外周血淋巴细胞的拖尾率和DNA损伤专用单位均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见,与小鼠骨髓细胞微核试验相比,单细胞凝胶电泳试验更加敏感,更适用于检测低毒性低浓度农药的遗传毒性。目前,许多国家和组织已将小鼠骨髓细胞微核试验作为验证受试物是否具有遗传毒性的一种标准的体内试验。本研究的微核试验结果表明,与阴性对照组比较,40和80mg/kg辛硫磷染毒组小鼠的骨髓细胞微核率显著性升高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着辛硫磷染毒剂量的升高,小鼠的骨髓细胞微核率均呈上升趋势。赵忠桂等研究发现,农满忆(由氰戊菊酯与辛硫磷混合而成)染毒后,能诱使雄性小鼠睾丸细胞和SD大鼠骨髓细胞微核率升高,且呈现剂量-效应关系;刘秀芳等研究发现,辛硫磷染毒雄性小鼠35d后,各染毒组小鼠骨髓细胞微核率均显著高于阴性对照组;且随着辛硫磷染毒剂量的升高,小鼠骨髓细胞微核率呈上升趋势,并具有剂量-效应关系。这与本研究结果一致。单细胞凝胶电泳试验又称彗星试验,具有很多优点,与目前已知的各种细胞水平的致突变测试方法相比更加敏感,其在农药遗传毒性研究和安全性评价中的应用越来越广泛。本研究的单细胞凝胶电泳试验结果显示,辛硫磷造成了小鼠外周血淋巴细胞DNA的损伤,各剂量辛硫磷染毒组小鼠外周血淋巴细胞的拖尾率和DNA损伤专用单位均升高,差异有统计学意义(P<0.05);且随着辛硫磷染毒剂量的升高,小鼠外周血淋巴细胞的拖尾率和DNA损伤专用单位均呈上升趋势。周亚莉等研究发现0.25mg/kg久效磷染毒就可导致小鼠骨髓细胞微核率显著升高,外周血淋巴细胞DNA损伤程度显著增加。本研究结果显示,40mg/kg辛硫磷染毒即可致小鼠的骨髓细胞微核率显著升高,10mg/kg辛硫磷染毒即可引起小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度显著增加。这说明辛硫磷对哺乳动物具有遗传毒性作用,但与高毒有机磷农药相比,毒性作用相对较低。综上所述,辛硫磷对小鼠具有遗传毒性,但与高毒有机磷农药相比,毒性作用相对较低,其机制尚不明确,仍需进一步