巨大芽孢杆菌的研究进展

巨大芽孢杆菌的研究进展

巨大的细菌是好氧菌和革兰氏阳性细菌。已经有100多年的研究历史了。20世纪50年代，中国的大型细菌文献开始于化学磷的生产中。随着研究的深入，巨大的细菌——抗生素和酶的存在广泛用于净化水质、农药分解、微生物肥料、抗生素合成和酶工业。本文简要介绍了大型鸡尾菌在微生物肥料、抗病性、动物育种、水处理和性能等方面的研究和应用，为大型鸡尾菌的进一步研究和应用提供了参考。1巨大芽孢杆菌氮磷钾是植物生长发育所必需的营养元素,以多种形式参与植物新陈代谢的不同生理生化过程.但是,全球耕地土壤普遍缺少氮磷钾元素,尤其我国的耕地土壤74%缺磷,60%缺钾,限制了农业发展.最初,通过施用磷、钾肥来缓解这种状况,但是磷肥施入土壤后由于淋失、挥发或被土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等离子结合形成难溶性磷酸盐,使作物不能吸收利用,导致磷、钾肥的利用率只有20%左右.长期依赖化学肥料提高农业生产力,不仅造成大量不可再生资源浪费,还导致耕地土质变差、农产品品质下降和环境污染.如何挖掘土壤潜在的磷资源,使难溶性磷转变为可被作物吸收利用的有效磷,降低化学肥料施用量,发展绿色农业,成为目前农业研究的热点问题.大量的研究证明微生物的活动能够影响土壤中磷的转化.因此,对解磷微生物的研究受到了农学、微生物学和植物学研究者的重视.巨大芽孢杆菌是一种解磷促钾细菌,能够分解土壤中的吸附态有机磷、无机磷,提高土壤肥力,促进作物增产.巨大芽孢杆菌作为解磷促钾细菌,是微生物肥料中的常用菌种.不仅对卵磷脂、土壤中植物不能吸收利用的吸附态磷有明显的分解作用,提高土壤有效磷含量,还能与固氮菌、解钾菌混合培养,增强固氮、解钾能力.有研究显示,巨大芽孢杆菌通过在作物根际定殖,利用代谢的有机酸将固定在土壤中的磷和钾转化为速效磷和速效钾起作用.同时,菌体溶解后,自身释放出一些可溶性磷钾,提高作物对磷钾的吸收利用.目前,国内对巨大芽孢杆菌在微生物肥料上的研究主要集中在菌株选育、解磷效果、发酵条件优化及与固氮菌、解钾菌相互作用等方面.张爱华等以巨大芽孢杆菌PS-01P菌株为出发菌,通过紫外线诱变,得到1株高解磷能力的菌株.陈凯等研究发现巨大芽孢杆菌P1具有较强的解磷能力,发酵培养优化实验表明,该菌对碳源、氮源及Mg2+、Mn2+、Ca2+等离子较敏感,通过各因素的优化搭配,可提高其发酵菌量,优化后的最佳培养基组分为:玉米粉20g,黄豆粉10g,K2HPO41.5g,MgSO4·7H2O1.5g,CaCO31.5g,H2O1000mL,pH=7.5,培养温度32℃,培养时间32h,活菌数达60×108cfu/mL,芽孢比率达90%以上.张维娜等以巨大芽孢杆菌JD-2为研究对象,发现JD-2具有较强降解有机磷、无机磷的能力,以106cfu/g的起始浓度接入土壤,便能达到较理想的解磷效果.巨大芽孢杆菌能够增加作物产量的研究已有报道.在油菜的种植中施用适量巨大芽孢杆菌菌剂,能够增加土壤有机质含量,促进根系生长,降低油菜中的硝酸盐含量,提高油菜生物量和增加产量.微生物之间存在着协同、竞争、拮抗等作用,探讨其具体关系有助于进一步开发多功能微生物肥料.常慧萍等从小麦根际分离出固氮菌、解磷菌和解钾菌,其中解磷菌能够促进固氮菌和解钾菌的生长繁殖.肥效试验显示,圆褐固氮菌、巨大芽孢杆菌制成的混合菌剂较各单一菌剂具有更好的肥料效果,能显著促进玉米株高、干质量和根长.另外,江丽华等采用固定化细胞技术对巨大芽孢杆菌、圆褐固氮菌和硅酸盐细菌混合菌液进行固定化处理,处理后混合液的保存期延长,特别有助于芽孢杆菌的保存.将固定化细胞技术引用到农业领域,改变了微生物存活期短的现状.巨大芽孢杆菌解磷机理的研究方面,据文献报道不同微生物存在不同的解磷机理,有些微生物解磷是通过质子起作用;有些是通过有机酸起作用;有些是通过分泌解磷酶类起作用;还有一些菌株在生长过程中产生一些螯合物,可溶解难溶性磷.而关于巨大芽孢杆菌的解磷机理,多数学者认为是通过“酶解作用”和“酸解作用”实现的.“酶解作用”,即巨大芽孢杆菌在降解有机磷时分泌出碱性或酸性磷酸酶、脱氢酶等物质使有机磷酸盐矿化,成为植物可以吸收利用的可溶性磷.研究显示,在有效磷浓度低于一定值使微生物感受到低磷胁迫时,胞内碱性磷酸酶会被诱导合成并不断积累,其酶量可达到胞内总蛋白的6%.“酸解作用”,即微生物在代谢过程中分泌有机酸,如乳酸、氨基酸、柠檬酸等,这些酸一方面直接溶解土壤中难溶性磷酸盐,另一方面通过螯合作用与Fe3+、Al3+、Ca2+等离子结合,溶解难溶性磷酸盐释放出磷.2巨大芽孢杆菌的抑菌作用芽孢杆菌作为植物病害生物防治的主要生防细菌,通过在生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物,以直接或间接方式阻碍或杀死病原菌.早期,研究较为深入的生防芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌及苏云金芽孢杆菌等,这些细菌多数是从植物的根际土壤、植株或叶片等处分离得到的,接种后易于在植物上定殖,生防效果持久稳定.近年来,有研究报道巨大芽孢杆菌是一种抑菌谱较广的生防菌株,对不同植物的真菌和细菌病害具有防治作用,如毛竹枯梢病、水稻纹枯病、烟草灰霉病、香蕉灰斑病、甘薯黑斑病等,其中,对真菌病原菌的抑制能力强于对细菌病原菌的抑制.秦健通过研究发现,巨大芽孢杆菌产生的抑菌物质为伊枯草菌素(IturinA2),该物质在酸性和弱碱性环境以及在胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K的作用下抑菌活性稳定;而高温处理会破坏其稳定性,如121℃处理20min后,抑菌活菌为23.20%.张新建等将外源几丁质酶基因导入巨大芽孢杆菌,发现该工程菌株对病原真菌的拮抗能力明显提高,其中对小麦纹枯病菌和棉花枯萎病菌的防效能力分别为70.34%、58.51%,相比原始菌株,防效分别提高27.54%和21.28%.表明,通过分子生物学的手段,可提高巨大芽孢杆菌的生防效果.此外,腾春红等分离出1株抗除草剂2、4-滴丁酯的巨大芽孢杆菌,并将该菌的抗性基因转入大豆,获得抗2、4-滴丁酯的大豆.这为解决大豆田多年生杂草问题提出了新措施,也启示我们,存在将微生物的生防基因转移到作物中的可能性,以降低农资成本.3巨大芽孢杆菌制剂随着我国畜牧养殖业的飞速发展,畜牧场的污水、畜禽排泄物及恶臭气体不仅对畜禽带来副作用,还严重污染环境,其中畜禽排泄物、污水、垫料等腐败分解释放出的氨气、硫化氢、硫醇类等恶臭气体,轻则降低空气质量,重则引发呼吸道等疾病.此外,畜禽消化道、呼吸道及体表皮脂腺、汗腺等也会散发出难闻的气味,这些恶臭气体成为全球最大的污染来源.因此,寻找能够抑制恶臭气体产生的物质越来越受到人们的重视.张艳云等研究发现,在日粮中添加巨大芽孢杆菌(浓度为2×106cfu/g)可降低冬季密闭鸡舍空气氨浓度53%~74%,硫化氢浓度55%~90%.霍永久等报道,巨大芽孢杆菌制剂可以减少猪粪氨气释放量.李晓刚通过试验发现,基础日粮中添加巨大芽孢杆菌不仅可以减少蛋鸡排泄物和肠道中氨气、硫化氢的产生和排放,还能提高蛋鸡对饲料营养物质的利用率,减少日采食量,提高产蛋率,并显著增加血清中钙和磷的含量.巨大芽孢杆菌是通过减少蛋鸡排泄物和肠道中氨氮、尿素氮、尿酸、总氮、可溶性硫化物、总硫的浓度,降低细菌脲酶和半胱氨酸脱巯基酶的活性,从而减少排泄物和肠道中氨气、硫化氢的产生和排放.有研究表明巨大芽孢杆菌可以分泌具有降解羽毛角蛋白和酪蛋白的水解酶,对于释放羽毛废弃物中的角蛋白和酪蛋白,生产动物饲料蛋白产品具有重要的意义.因此,巨大芽孢杆菌不仅可以改善畜牧养殖环境,而且可以变废为宝,提高畜牧养殖效益.4巨大芽孢杆菌对水体的生物活性成分目前,对巨大芽孢杆菌的研究正方兴未艾,从传统的菌种筛选、发酵条件优化、生理生化功能及在微生物肥料上的应用,发展到一些特殊功能的研究和改造,如水体净化、基因功能和蛋白表达等.巨大芽孢杆菌在水体净化上的报道较少,主要集中在对水体中有机物和氮磷的降解及修复水体富营养化等方面.有研究表明巨大芽孢杆菌可分泌生物表面活性剂,有效提高原油的降解效率,这对海洋中原油的污染净化具有重要的意义.匡群等报道,巨大芽孢杆菌对养殖水体中的亚硝酸盐有较强的降解能力,并且能够降解水体中的难溶性磷,提高可溶性正磷酸盐的水平.可见,巨大芽孢杆菌不仅能提高养殖水体的质量,对正磷酸盐偏低的水体也具有一定的应用价值.王琳等利用巨大芽孢杆菌对富营养化景观水体进行处理,结果显示,巨大芽孢杆菌能够有效去除水体中的有机物、氮、磷,控制藻类生长,起到净化富营养化水体的作用.由此可见,巨大芽孢杆菌在水体净化上具有一定的作用,可开发为水质微生态制剂应用到水源匮乏的养殖区域,降低养殖成本,提高养殖效益.5巨大芽孢杆菌在巨大芽孢杆菌中的表达20世纪90年代,国外学者就开发出巨大芽孢杆菌的原核蛋白表达系统,研究发现该系统与传统的原核表达系统(如大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统)相比,具有外源蛋白分泌能力强且不产内毒素;载体质粒稳定且不产生或很少产生胞外蛋白酶;胞外蛋白易于提取且提取成本低;使用的诱导剂廉价等优点.与哺乳动物表达系统相比,不存在培养时间长、支原体和病毒污染难控制等问题.基于该表达系统的优点,我国学者也展开了对该表达系统的研究,如内切葡聚糖酶、中性植酸酶、耐碱性木聚糖酶、碱性α-淀粉酶等均在巨大芽孢杆菌中得到高活性表达.其中,中性植酸酶和耐碱性木聚糖酶分别是从枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌中克隆得到的酶基因,转化到巨大芽孢杆菌,经过诱导,获得外源蛋白的高活性表达.郭德军等在综述中指出,利用巨大芽孢杆菌获得的多种酶的高效活性表达,与表达基因本身使用的密码子和宿主密码子的偏爱性有关,因为和巨大芽孢杆菌亲缘关系较远的基因,如人和鼠的某些基因,在巨大芽孢杆菌中表达量并不高.而李勇等根据巨大芽孢杆菌表达系统优化牛凝乳酶基因序列,将优化后的基因序列与穿梭质粒pHIS1525连接,转化到巨大芽孢杆菌,得到了牛凝乳基因在巨大芽孢杆菌中的高效表达,并证实该重组酶与原酶的酶学性质基本相同.这是国内外少有关于在巨大芽孢杆菌中高效表达动物性外源蛋白的报道,显示出该表达系统良好的应用前景.近年来,有研究报道,巨大芽孢杆菌是异源表达的优良寄主,可有效分泌来源于八叠球菌ATCC13881S-层蛋白SsLA的血凝素(HA)表位蛋白.此外,有研究显示,通过添加5mmol/L的色氨酸、天冬氨酸、组氨酸、谷氨酸和赖氨酸可以增加巨大芽孢杆菌中绿色荧光蛋白的表达.有文献报道过表达木聚糖酶基因的巨大芽孢杆菌可用于增强造纸过程中纸张的亮度,并在保证纸张亮度和质量的基础上减少氯化物的使用量;若与其他纤维素酶混合使用,还可增加回收造纸污泥的糖化率,减少造纸的成本.6微生物肥料的应用巨大芽孢杆菌是一种很有潜力的功能型细菌.它能够利用多种碳源如LB培养基、NA培养基等,营养要求低,培养条件简便,适合工业化生产.它是有机磷分解菌,产生的芽孢抗逆性强,制成的菌剂易于运输和保存,是微生物菌肥理想的菌株.制成的微生物肥料应用于多种作物,既能改善土壤微生物环境,增加土壤肥力,提高作物生物量和增加产量,又能防治多种病虫害,提高作物品质.作为