解磷细菌的功能及在农业生产中的应用

解磷细菌的功能及在农业生产中的应用

磷酸是植物生长发育所必需的矿质因素之一。然而，中国74%的耕地土壤中没有磷，95%以上的土壤中的磷是无效的，植物很难使用。在生产中多施用高水溶性磷肥满足植物对磷的需求,但是磷肥施入土壤后易形成难溶性的磷酸盐并迅速被土壤矿物吸附固定或为微生物固持,其当季利用率仅为10%~25%。如何提高土壤磷素利用率已成为目前科学研究的热点问题之一。研究发现,微生物对土壤中磷的转化起关键作用。科学家们从土壤中分离出了能够将植物难以吸收的磷转化为可利用状态磷的解磷细菌。大量试验证实,向土壤中施用解磷细菌,不仅能够增加作物磷素吸收量,提高作物产量,还能大大提高磷肥利用率,减少农业面源污染。因此,在农业生产中使用解磷细菌是实现农业可持续发展的重要途径。本文综述了近些年来国内外对解磷细菌的种类、数量、生态分布、解磷机制、解磷能力和菌体筛选分离的研究以及在农业生产中的应用和研究前景,以期为解磷细菌的进一步研究和应用提供参考。1关于磷细菌的研究1.1对土壤、土壤微生物物种多样性的认识土壤中能够分解磷素的微生物很多,以解磷细菌为主。目前报道的解磷细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、肠细菌属(Enterbacter)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)、根瘤菌属(Bradyrhizobium)、沙门氏菌属(Salmonella)、色杆菌属(Clromobacterium)、产碱菌属(Alcali-genes)、节细菌属(Arthrobacter)、多硫杆菌属(Thiobacillus)、硫氧化硫功菌属(Thiobacillusthiooxidans)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)和沙雷氏菌属(Serratia)。但是,不同的土壤、不同作物根际中解磷细菌的数量和种群分布都存在一定的差异。有研究发现,黑钙土中解磷细菌最多,为4.89×l07cfu/g,瓦碱土最少,仅有2×104cfu/g。尹瑞玲调查了我国旱地土壤中的解无机磷菌,发现平均1g土壤中约有1000万个,占土壤微生物总数的27.1%~82.1%,其中以黑钙土中解磷菌数量最多,而红壤、砖红壤中数量最少。林启美等通过分析农田、林地、草地和菜地4种土壤有机磷细菌和无机磷细菌的数量及种群结构,发现有机磷细菌数量比无机磷细菌多;有机磷细菌主要是芽孢杆菌属,其次是假单胞菌属;而无机磷细菌主要是假单胞菌属;菜地土壤解磷细菌的数量和种类最多。解磷细菌有强烈的根际效应,不同土壤中,解磷微生物的数量差异较大,在植物根际的数量要远远高于其周围土壤中的数量。赵小蓉等通过研究玉米根际与非根际解磷细菌的分布特点,进一步得出根际微生物的数量可能主要受根系分泌物数量的控制,而根际微生物群落结构则可能主要受根系分泌物类型的影响的结论。1.2土壤微生物对磷的氧化作用早在19世纪初就有土壤学家指出土壤微生物对磷的转化作用。解磷细菌的解磷机理复杂多样,目前多数学者认为解磷细菌的解磷机制主要有两方面。1.2.1解磷细菌的作用一般认为,磷细菌降解无机磷化物的机理有:(1)解磷细菌在生命活动中会产生可以溶解土壤中难溶性磷酸盐的有机酸,如乳酸、氨基乙酸、草酸、盐胡索酸、琥珀酸、2-葡糖酮酸和柠檬酸等。(2)解磷细菌释放出的H2S与磷酸铁反应产生硫酸亚铁和可溶性的磷酸盐。(3)解磷细菌的呼吸作用放出CO2,降低环境pH值,引起磷酸盐的溶解。(4)解磷细菌能够吸收钙离子,使磷酸根离子进入土壤溶液。(5)植物残体腐解能产生胡敏酸和富里酸,并与复合磷酸盐中的钙、铁和铝螯合释放出磷酸根。另外,它们也可以与铁、铝及磷酸盐形成稳定的可溶性复合物而被植物体吸收利用。(6)解磷细菌通过NH4+的同化作用放出质子,降低pH值,从而引起磷酸盐的溶解。国外研究发现一些解磷菌只有在介质中有NH4+存在时,才具有溶解无机磷酸盐的能力。(7)当某些异氧型解磷细菌的生存环境氧化状况发生改变时,它们能够将不溶态磷酸盐转化为可溶态的亚磷酸盐和次磷酸盐。如丁酸梭状芽孢杆菌(Clos-tridiumbutyricum)在极其潮湿厌氧状态的土壤中,能将磷酸盐转化为亚磷酸盐和次磷酸盐,从而被植物吸收利用。此外,有人发现解磷细菌在根际土壤中能否解磷,可能与根际存在的营养物质种类及根际环境pH值变化有密切关系,如磷细菌在碱性基质中同样产酸,但由于碱性反应而不能发挥有机酸作用,表现为不解磷。但是,有研究证明解磷量虽然与培养液中的pH值存在一定的相关性,但培养介质中的pH值的下降不是微生物解磷的必要条件。1.2.2对磷细菌的控制作用一般认为,磷细菌对有机磷酸酯的分解是通过分泌胞外磷酸酶进行解酶而实现的。但是研究发现,当有效磷浓度低于某一阈值使微生物和植物感到低磷胁迫时,微生物和植物就会分泌胞外磷酸酶,将有机磷水解,释放出有效磷。已证实在土壤中接种解磷的巨大芽孢杆菌(Bachillusmegatheriumvar.phosphaticum)后,土壤无机磷质量分数提高了15%以上;在含有有机磷较高的松软土壤中接种巨大芽孢杆菌效果更显著。主要原因是解磷细菌把有机磷释放出来,转化为可利用的无机磷。另外,梁锦锋通过试验发现,有机磷化物对于磷细菌菌体的生长存在着抑制作用,同时对于磷细菌利用有机磷又存在诱导作用。此外,解磷细菌细胞对磷素有固定与释放作用。可溶性磷酸盐进入细菌细胞后被固定,当细胞死亡后,又重新释放并被植物吸收利用。微生物对土壤磷素的固定与释放,主要受土壤中可降解有机物含磷量的影响。1.3培养基及微生物活性不同种类的解磷细菌,其解磷能力差异较大。宫占元等以氧化乐果和水胺硫磷为唯一磷源,接种4株细菌,发现同一菌属的不同菌株解磷能力差异较大,且4株细菌不仅能分解有机磷类物质,还具有降解农药的功效,这一发现对环境保护和农药污染治理等方面具有重要价值。有专家认为微生物的解磷能力首先取决于微生物本身的特征,如分泌质子、有机酸和其他物质的数量和种类,其次与难溶性磷酸盐的结构和组成成分有关。赵小蓉等发现,解磷细菌的解磷量与培养液中的pH值存在一定的相关性(r=-0.732)。国内的一些研究也发现解磷能力与pH值和菌体数量存在相关性,菌体数量增多、酸度降低时细菌的解磷能力提高。细菌的解磷能力不仅与pH值有关,而且还很可能受到底物的诱导作用。环境中过高的有效磷对磷细菌的解磷能力存在抑制作用。但是,有许多研究发现,真菌的解磷能力高于细菌。目前,测定磷细菌解磷能力的方法主要有3种:一是将磷细菌接种在特定的培养基上进行培养,培养后测量其周围较透明的溶磷圈的直径,通过比较直径大小来确定菌种的解磷能力;二是将解磷细菌接种至含有磷养分的培养液中,用未接种过解磷细菌的培养液作对照,同时进行培养,一段时间后,用钼蓝比色法间接测出培养液中可溶性磷素的含量,从而反映磷细菌的解磷能力;三是采用同位素示踪法。赵小蓉等采用熏蒸、消煮等方法,测定沙培过程中细菌分解出来的磷,这是目前较为准确地测定细菌分解磷能力的方法。1.4在生物活性成分上的应用土壤类型、肥力、耕作方式等均会对磷细菌在土壤中的分布和数量产生影响。1950年,我国前东北农科所从东北黑土和灰化土中分离出能分解有机磷的巨大芽孢杆菌。20世纪80年代又推出了多种芽孢杆菌,如腊状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、坚强芽孢杆菌(B.firmus),但同时发现由于解磷细菌的遗传稳定性差,这些菌剂在生产上的应用并不理想。有一些研究主要进行了解磷细菌的分离和筛选,目的是为了得到解磷能力强的菌株,从中克隆出与解磷有关的基因,为构建固氮和解磷的复合工程菌提供基本资料。李繁等从200多个可以在蒙金娜有机磷水平上生长的菌落中,筛选分离出了7株有机磷细菌,通过生理生化试验、16SrDNA序列测定、G+C含量、DNA-DNA杂交等研究方法,得出了这7个解磷细菌分属于假单胞菌属、芽孢杆菌属、不动杆菌属和寡养单胞菌属。这一研究结果与国外研究相一致。近来,有人利用基因工程技术将Bacillus.sP.DS11中的Phytase基因phy导入Escheerichiacili构成基因工程菌,以应用于降解释放无机磷。一般认为,生物有效磷对生物固氮作用非常重要,在一定浓度范围内,生物有效磷水平限制了生物的固氮能力。目前多采用稀释平板培养法对土壤中的解磷细菌进行划线分离筛选。在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(液培时不加琼脂)上适当加入含有磷素的物质(有机磷细菌的培养基加入蛋黄或卵磷脂,无机磷细菌培养基加入磷酸钙),初培养后,根据菌落的大小、形状、颜色及生长速度等特性挑选出优质菌株,将其接种到特定的有机或无机磷细菌培养基上进行再培养,后测量其周围较为透明的溶磷圈直径,溶磷圈直径大说明此种菌的解磷能力强。2应注意消除磷细菌对农业生产的影响2.1解磷细菌对作物中磷的吸收国外解磷细菌的研究开展得比较早。前苏联学者蒙基娜于1935年从土壤中分离到的一种解磷巨大芽孢杆菌能够分解核酸和卵磷脂,该菌种于1947年大量生产并广泛应用于前苏联和东欧各国。据报道,接种后的土壤中五氧化二磷提高了15%以上。Chabot等人研究了几株溶磷菌对农作物生长的影响,发现其能促进西红柿、洋葱、马铃薯、香蕉、柑橘、咖啡及其他可栽培作物吸磷的提高,解磷菌株BurkholderiacepaciaIS-16已被用作生物菌肥,施用于多种作物。我国的解磷细菌研究始于20世纪50年代。前东北农科所首先从东北黑土和灰化土中分离出了具有很强解有机磷能力的解磷大芽孢杆菌,并将其制成了菌肥在黑钙土和非黑钙土上施用,发现不同作物增产幅度不同,黑钙土平均增产13.5%,非黑钙土为11.7%,幅度为6.1%~22.8%。同期,北京市农业科学院进行了解磷细菌肥料的研究和应用,开展了有效施用条件、解磷作用、刺激作用及土壤微生物对解磷细菌的影响等试验,得到了很多有价值的数据和实践经验。李淑高在盆栽和大田试验中将磷肥和解磷细菌混合使用,在大豆生产中增产36.9%;在施用磷菌肥之后,作物对磷的吸收也有显著增加,解磷细菌与过磷酸钙或与钢渣混合施用,比对照组的大豆吸磷量分别增加12.3%和6.2%。目前有研究人员筛选出B2和B67菌株研制的解磷菌剂,进行盆栽和大田试验,发现解磷细菌除了能显著提高土壤速效磷含量、培肥土壤外,同时还有改善作物农艺性状、提高作物产量的功效。孙华等在山东省的砂姜黑土中分别加入有机肥和一定量的溶磷细菌的肥料,发现解磷细菌不仅提高了土壤中的中等活性有机磷和活性有机磷含量,还促进了土壤中Ca8-P、Ca10-P向Ca2-P、Al-P、Fe-P等形态无机磷的转化,从而提高土壤有效磷的含量。国内外的大量试验和研究表明,将解磷细菌施入土壤不仅可以提高磷肥的有效性,还可以活化土壤中的固定态磷,提高磷素利用率。2.2配合使用,发挥解磷能力目前关于解磷细菌的研究比较多,但将解磷细菌应用于农业生产中还有一些应注意的问题。研究发现,解磷细菌在缺磷而有机质较丰富的土壤中使用效果更好,因此在使用之前应了解解磷范围和环境。同时研究表明,解磷细菌与磷矿粉配合使用更能发挥其解磷能力。解磷细菌制成的菌肥结合堆肥使用比单施效果明显,即在堆肥中接入磷细菌,进行分解,然后将堆肥翻入土壤,如果不同类型的解磷菌种互不拮抗,即可以复合使用。此外,在使用中还应注意解磷细菌在不同作物上的施用量,以便使解磷细菌最大限度地发挥解磷功效。云霄县农科所早在20世纪70年代就鉴定了磷菌肥的肥效,认为磷菌肥不宜与杀菌剂同时混用,而且在施用中要注意避强光曝晒和过干过热。北京市农业科学院同期也得到了一些实践经验,他们认为在施用磷菌肥时,土壤湿度以20%左右为宜;晚播小麦施用磷菌肥的效果不如早播小麦;用磷菌肥拌种时,不宜与乐果、敌百虫等同时使用,也不宜用硫铵作种肥。3解磷细菌与微生物的相互作用解磷细菌在我国研究已有多年,但发展并不快,主要是由于磷细菌种类繁多,解磷机制复杂且不尽相同。以前研究多局限于解磷细菌的筛选和解磷能力的比较,对于解磷细菌在土壤中的活动和消长动态等研究较少。因此,对于解磷细菌的研究工作可从以下几个方面加强。(1)研究解磷细菌与其他功能微生物之间的关系,如与自生固氮菌、根瘤菌、硅酸盐细菌等的相互作用,特别要注意解磷细菌与病原菌发生发展的关系,并深入探讨解磷细菌代谢产物与植物生长的关系,为研制多功能的高效复合菌剂奠定基础。(2)从分子生物水平