曲霉型豆豉发酵机理及其功能性的研究(可编辑)

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曲霉型豆豉发酵机理及其功能性的研究曲霉型豆豉发酵机理及其功能性的研究（可编辑）【完整版】(文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用,可编辑放心下载）中国农业大学博士学位论文曲霉型豆豉发酵机理及其功能性的研究姓名:张建华申请学位级别:博士专业:食品科学指导教师:李里特20030501要摘豆豉与豆酱、酱油、腐乳井列为我国四大传统火豆发酵制品,且自古以来药禽两川。迄今还削丁儿种中药制剂中。然而豆豉至今仍以自然发酵、作坊式生产为主.剥其发酵过程和生理功能研究甚少。本文主要是从自然发酵曲霉型豆豉曲中筛选出发酵菌株,研究其发酵特性,优化其纯种发酵艺,并对发酵过程中产品的成分变化及不同菌株发酵产品的功能性进行研究,主要内容如下:首次对白然发酵曲霉型豆豉曲中的微生物分布进行研究,并对其中的曲霉菌进行分离鉴定,发现主要发酵菌株是埃及曲霉叫和米曲霉原变种叫,而烟曲霉爿和寄生曲霉似的存在.说明豆豉存在微生物平安隐患。.口蛋白质或多肽和异黄酮是大豆及其发酵制品中的主要功能性成分,本课题以中性蛋白酶和.葡萄糖苷酶酶活为指标,筛选出埃及曲霉作为本研究的制曲发酵微生物。以湿度、温度和发酵时间为自变量,.葡萄糖苷酶和中性蛋白酶酶活为囚变量,利川』心组合设计,建立了二次多项式回归方程模型,优化了纯种发酵的制曲条件。根据后酵过程中氨基氯和总酸的变化,确定了后酵条件。.对纯种发酵过程中营养、风味和功能胜成分的含量变化进行了分析。发酵后蛋白质、氮基酸和有机酸的变化说明发酵有利于提高产品的风味和营养。发酵天的成品豆豉中,.%的黄豆苷和.%的染料木苷转化为苷元,有利于提高产品的生理功能。纯种发酵豆豉曲具有较好的抗氧化活性和血管紧张素转换酶抑制活性,。随着制曲发酵时间延长而提高:后酵过程中,其又有进一步的提高。可纯种发酵豆豉曲的不受作用的影响,在肠胃蛋白酶作用大幅度提高,因此曲中抑制剂应为前药型和抑制型的多肽混合物。凝胶层析结果说明埃及曲霉纯种发酵曲中共有四个组分具有,经肠胃蛋白酶水解后具有的多肽分子量较水解前有所下降。用对各组分进行分析,发现组分只有’~个洗脱峰。对组分进行氨基酸分析,证明其为苯丙氨酸、异亮氨酸和甘氨酸绍成的多肽。.自然发酵豆豉曲有较好的.葡萄糖苷酶抑制活性,但不同菌种纯种发酵产品间一葡翎精苷酶抑制活性差异较大,成品豆豉的.葡萄糖苷酶抑制活性较曲的活性低。加热对样品中。一葡萄糖苷酶抑制活性影响不大。关键词:曲霉豆豉发酵功能性抑制,,,,,.,,,.,?,.:.,.,/』向..,,.,?.....,,.%.。.%,..,,.?.?爿,中田农业大学博士论文摘盐,,,...??.:独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致身十的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何奉献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:刊:沙;年厂月力日,钥蕴绛关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保存、使用学位论文的规定,即:学校有权保存送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或局部内容。保密的学位论文在解密后应遵守此协议时间:;年月椤日研究生签名:魔妻绎洲:明钳聊【别磁轹夸智第一章绪论.研究的目的和意义..大豆开展的机遇和挑战中国是大豆的故土,几千年来,大豆为中华民族的繁衍生息做出,不可磨灭的奉献,而大豆食品也成为中国传统食品中的一朵奇葩。近几年全世界大豆的总产量及主产国的产量如表.所示。表大豆主要生产国的年产量?万吨.表中数据显示,世界大豆产量逐年提高,而我国大豆产量多年来一直徘徊不前,年后被阿根廷超过,仅列第位川。受国外大豆价格的冲击,年我国第一次由传统的大豆净出国变成大豆净进口国,且进口量不断增大,至年已达万吨见表。表中国大豆生产和进出口情况.年份口总产进口净进口净出口万吨万吨万吨万吨万吨..分析中外大豆开展趋势不同的原因,主要有以几个方面:生产应用方面。国外大豆品种油脂含量高,蛋白质含量低,作为油料具有较好的经济价值。而国产大豆蛋白质含量平均为%~%,最高达%,适合于加工蛋白食品。但目前我国大豆的利用主要以油脂生产为主见图.,生产经济效益低,没有表达出商蛋白质作物的价值¨。价格方面。尽管自年以来,大豆收购价格略有增加,但种植大豆的收益仍低于小麦和玉米等,所以种植面积有所降〞。官传方面。宜传力度不够,使我国消费者对人豆食品的优越性认识缺乏,没有形成对人互食品的新的。消费需求,这些现象和目前国际上的大豆食品消费热形成强烈的反筹绪论中国农业大学博士论文年以来,美国大豆食品的消费量每年以%以上的速度增长。其增长的原动力,不仅仅是大豆的营养和风味,更主要是人豆蛋白和大豆异黄酮的生理功能¨,如降低乳腺癌、前列腺癌、肠癌等疾病的发病率,缓解妇女的更年期综合症和骨质疏松症等。年月日,批准,但凡一次常规食用量含大豆蛋白.以上的食品可以标以该局许可的“可能会减少患心脏病的危险〞的健康食品说明,这也是自年以来通过的关于食图我国大豆加工产品的比例分布品的第二个健康通告。正是这些研究成果,打睡.破了过去大豆在美国只是作为油料和饲料的局限,美国的食品企业趁机推出各种西式大豆食品,如豆奶、大豆汉堡或热狗等:同时将传统大豆食品,如豆腐、天培等融合到美国饮食文化中,设计出许多符合美国消费者饮食习惯的大豆食品烹饪配方¨。大豆异黄酮和大豆蛋白的生理功能,符合现代消费者的健康取向,因此大豆产品的开发在全球受到了前所未有的重视,许多新产品应运而生,且高科技的应用成为新产品开发的一个特点。这一方面为大豆产业的开展带来了机遇,另一方面,也给我国的大豆研究和生产带来了挑战。如何利用我国几千年大豆种植和加工的经验,结合现代高科技,发挥我国大豆的优势,开发出有市场前景的现代化工业产品,是摆在我国科技工作者面前的一个重大课题。..提高大豆消费的出路在于开展传统大豆食品如前所述,当前我国大豆加工主要集中在三个方面:油脂工业、新兴豆制品加工和传统豆制品加工。大豆作为油脂加工的原料,主要是利用大豆油脂及其副产品,其饼粕的应用因蛋白变性和溶剂残留等问题,受到了很大的限制,大局部被用作饲料加工。国产大豆蛋白质含量高,且大豆蛋白是消化率和氨基酸评分最高的蛋白之一,根据的蛋白质评价指标,被评为最优级。所以国产大豆用于油脂工业不能发挥其优势,甚至可以说是优良大豆蛋白的。种资源浪费。也正是因为我国火豆的高蛋白含量,尽管日本的油料大豆主要从美国进口万吨/年,但每年仍需从我国进口约万吨大豆用于制作豆腐和纳豆等?。新兴豆制品主要包括豆奶类、大豆浓缩蛋白、大豆别离蛋白、大豆纤维蛋白等产品〞。豆奶是直接饮用,大豆纤维蛋白主要作为肉的代用品,但两者的产量并不大。而产量较大的大豆浓缩蛋白和大豆别离蛋白,是为了利用饼粕中的人豆蛋白而开发的副产品,主要是作为食晶添加剂使用,添加量较少,使用时主要是考虑其功能性如乳化性、乳化稳定性、保水性和吸油性等。大显浓缩蛋白和大且别离蛋白的生产设备如喷雾枯燥塔等要求较高,投资较大,产品本钱较高。中国传统大豆食品可分为发酵豆制品‘,非发酵豆制品,发酵豆制品包括疆浆、豆腐、腐竹及其加:【而成的各类豆制品,发酵豆制品包括腐乳、豆豉、豆酱、酱油等。发酵豆制品的生产均需经过?个或几个微牛物发酵过程,在此过程中发生了‘系列复杂的生化过程,使其制鼎具有特中国农业大学博士论文绪论定的形态、风味与营养。豆腐、腐乳、豆豉等均是利用全脂天然人豆加工而成,具有营养丰富、易下消化吸收等优点,在我国有悠久的生产历史,已成为我国饮食文化的重要组成局部,具有较好的消费根底。尤其是发酵大豆制品,不仅保持了大豆食品的营养,还丰富了产品的风味,延长了产品的货架寿命,使产品能够更好地流通;且在发酵过程中会生成一些新的功能性物质,有利于消费者的健康:同时传统大豆制品的生产还具有上艺简单,设备投资较小等优势。综上所述传统大豆制品具有营养利用充分、口味丰富、符合我国的饮食文化、上艺简单、设备投资小等优点,具有较大的开展空间。美国?经济展望?杂志认为:未来年,最成功且最具市场潜力的并非汽车、电子产品,而是中国的豆腐等传统大豆食品。有人预言到年世界大豆产量的一半将用于制作大豆食品,东方的豆腐和豆制品将风行全球口“。..研究曲霉型豆豉发酵过程及其功能性的意义传统火豆发酵食品,因其特有的风味而倍受消费者青睐。豆豉与豆酱、酱油、腐乳并列为我国四大传统大豆发酵制品,其中腐乳、酱油的生产已根本实现工业化,而豆豉的研究却相对较少,当前的生产模式也是以作坊式为主。豆豉的起源可追溯到汉朝以前,至少已有两千年的生产历史,自古以来,深受人们喜爱,素有“南方人不可一日无豉,北方人不可一日无酱〞之说。豆豉品种繁多.在中国不同地区有不同的生产工艺,传到国外后根据当地的气候又衍生出一些新的工艺和产品。根据发酵微生物不同可分为四大类:细菌型豆豉、毛霉型豆豉、根霉型豆豉和曲霉型豆豉见表.。不同生产工艺都有其具代表性的著名品牌,其中曲霉型起源最早且分布最广,其艺流程见图.,主要由前处理、制曲和后酵三大步骤组成。表豆豉按发酵微生物的分类.盐、水、调味料固一清理一浸泡一蒸煮一沥十冷却一自然接种一培养一固一水洗一混合一发酵一旦壁枯燥千百菇图曲霉型豆鼓生产工艺??.首先考察一下豆豉在国外的开展情况,纳豆和天培是我国豆豉传到国外后,为适应当地气候和文化『丽改造的产品。纳豆的传统制法,是将蒸煮大显以稻草包裹,由稻草提供的枯草芽孢杆菌等发酵而成。久培是将浸泡、去皮后的蒸煮火显用较火的热带植物州子包裹后发酵。两者的传统制作方法均是自然发酵、手丁作业,后来从自然发酵的产品中筛选或培育出优良菌株,对菌株的发酵特性进行了全面深入的研究。使生产接近标准化。同时加强生产设备的开发,实现了生产的工业化,两者的生产二艺见图.。煮一浸泡水煮一沥干冷却一接种一装盘一盖纸一固一分级一加热一用磨去皮一皮别离一加酸水培养一三至一枯燥一装袋一小粒大豆一清洗一浸泡过夜一蒸煮一沥一冷却至?。一接种一装盒或装袋一培养一后熟一纳再一臣困图.天培、纳豆的生产工艺豆豉、纳豆和天培生产工艺的比较见表.。从表中可以看出曲霉型、毛霉型豆豉与天培都是大豆经前处理后.接种霉菌固体发酵:而纳豆和细菌型豆豉那么都是接种细菌进行发酵。但纳豆与天培发酵时间短,且没有豆豉生产的后酵过程。表纳豆、夭培和豆豉生产工艺的比较.,纳豆最早也只足日本的一个地域性产品,白年须见洋行发现纳豆中的纳豆激酶有较强的溶血栓效果而.才掀起对其生理功能研究的热潮。臼本全国纳豆联合会通过互联网对位消费者进行了纳豆功能性认识程度和吸引力的调查,调查结果如图.所示。结果说明消费者对纳豆调理肠胃的效果认识程度最高,%,其次为抗黹杀菌效果.%、美容效果.%、%、壮旨%。对纳豆的箨种成效.都引降低胆周醇%、预防靠栓.%、癌症预防起了消费者很高的兴趣。集众多功能一身为纳豆的宣传提供丁素材,使名不见经传的纳豆一跃成为界知名产品,日本人甚至手】Ⅲ了纳豆轹救十:界的口号。口本在纳豆的生产技术方面也进行了系统的研究,有中国农业大学博十论文绪论成套的生产设备,具体的丁艺参数,生产近于标准化。同时还开发出纳豆系列产品,如纳豆饮料、纳豆冰淇淋等。在日本所有豆制品中;其产量仅次于显腐,而纳豆激酶胶囊也已临床应用,年产值达亿日元左右。根据对日本人口超过万的城市统计数据,口本人对纳豆的户均消费量年超过日元,年达臼元.当年产值高达,亿同元相当于亿美元。年,生产纳豆的人豆用量为万吨左右。且近年生产量仍在上升。圈纳豆的生理功能及在本的影响.天培是印尼爪哇岛热带气候条件下生产的一种大豆发酵产品,其族维生素含量较高,特别是富含植物性食品中普遍缺乏的Ⅲ,因此成为西方素食主义者所热衷的食品。天培油炸后作为肉的代州一镐参加汉堡或热狗中.既可增加产晶的风味,又可补充素食者的维生素,因此通过移民传播后艮陕欧美得到迅速的开展和广泛的研究.这些研究成果义为天培的::业化生产奠定坚实的根底,现在天培已出现在世界上最高档次的食品超市中,甄豉与纳显和天培不同,在前期发酵后。往发酵人豆曲中添加香辛料后进行密封、后酵,使产锅眯更加丰富,但产:品中含盐最高,那么不利提高其消费量。中吲农业大学博士论文缔’,传统的中医药学宝库一样,中国传统养生饮食中也有很多瑰宝值得挖捌。采川现代利学分析手段对传统发酵食品中有效成分进行定性定量分析后,利用丰富的微生物资源车¨高科技米进行】.业化生产,是一条前景广‘阔的开展道路日本的纳豆激酶开发就是其中成功的范例之。豆豉白占药食同用,历代医籍都有豆豉防治疾病的记载。?本草纲目?中记载,显豉的疗效:开胃增食、消食化滞、发汗解肌、除烦平喘、驱风散寒、治水土不服、解山岚瘴气等。而以黄豆为主料,以青蒿、桑叶等为辅料的传统发酵产品淡豆豉,被?中华人民共和国药典?年收录,被认为是食疗保健药品。由此说明豆豉中不仅含有风味成分而且含有功能性成分。即使现在,豆豉还被参加几种中药制剂中。然而人们对豆豉生理功能还处于感性认识阶段,儿乎没有进行科学研究。由豆豉的生产方式落后,产品质量不稳定;且对传统产品的价值认识不够,没有引起重视,所以研究非常有限。广阔消费者主要将豆豉作为一种营养丰富的调味佳品,对其生理功能知之甚少。不过四川成都调味品研究所筛选出供生产崩的毛霉菌种,实现毛霉型豆豉州化乍产后,产品畅销海内外,出口到加拿人等地。毛霉型豆豉发酵温度低,生产周期睦;而曲霉凶适丁中温培养,生产周期相对较短。应更具有开发价值。同时,日本面酱和酱油等许多曲霉型发酵制品的抗氧化功能、降血压功能和日本学者研究发现的曲霉型豆豉预防.型糖尿病的成效,还有大显蛋白和异黄酮本身的抗癌,降血脂,预防骨质疏松、动脉粥样硬化等功能,预示曲霉型豆豉具有研究意义。借鉴纳豆和天培的成功经验.在继承曲霉型豆豉美味可口、营养丰富等优点的根底上,对其生产。艺等进行工业化改造,同时通过菌种选育和工艺改进,提高产品的营养、风味和生理功能.寻求新的消费热点,扩大豆豉的消费。一方面可让这一优秀的传统美食继续发扬光大,同时可以充分利其功能性为全民造福:另一方面通过研究成果的宣传,提高消费者对大豆食品的认识,从而拉动火旦消费。.国内外研究现状.豆豉发酵微生物的研究尽管~豉吊种繁多。生产历史悠久,然而国内对豆豉的研究却屈指可数,对参‘儿豉发酵的微生物及发酵过程中的生物化学变化等知之甚少。但国外对天培等霉菌固体芨酵产品的微生物研究却取得较多的成果.在天培发酵微生物的种类、作用和平安性方面进行了如的研究。年研究了发酵过程中少孢根霉对人曼炉藏蛋向、脂肪、寡糖平『植酸的实际降解作用,首次提出少孢根霉是天培生产的理想菌株;年,等对从印尼天培中别离出的个细菌进行检测,发现佗合成的主要曲种为兜氏肘炎曲、臭鼻肺炎茵,.,枸橡酸荫‘加和阴沟肠细菡,为后来根霉卣和兜氏肺炎菌混合发酵以提高。业化天培产,中?含姑的艺提供依据?。年,对荷兰市场中犬培产品的发酵微生物进,另、少孢根霉和毛霉“究,发现士要发酵微生物为米根霉等也被发墁仔柏人培中〞“;外苍做毛霉弛∞,白地霉中闻农业大学博士论文绪论年,对酸化一序的产酸微生物进行了分析,发现丰要作用菌是干酪乳杆菌、粪肠球菌、停乳链球菌其中少表皮葡萄球菌?;同年,【训发现根霉菌可形成核黄素、尼克酸、烟碱和孢根霉发酵天培中维生素含量最高,但根霉菌对的形成没有奉献。〞〞的研究表明用根霉和细菌混合发酵有利于天培品质的提高,克少孢根霉和米根霉混合发酵的天培中、、麦角固醇和的量可到达日推荐量,¨、可达日推荐量的一半,叶酸那么可达日推荐量的四分之一。而将根霉与枸椽酸菌混合接种那么可提高的含量。年,对天培的微生物平安进行了研究,发现未经酸浸的产品中金葡球菌、蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌在一些样品中可达’/,并在一些样品中发现了叶沙尼亚菌,说明早期的天培产品存在平安隐患。研究发现少孢根霉可抑制黄曲霉的生长、发芽和黄曲霉毒素、肉毒毒素的产生,在常见的小时发酵产品中没有肉毒毒素生成“?;年的研究结果说明在酸化后的大豆中接种胚芽乳杆菌
使蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、婴儿沙门氏菌出和产气肠杆菌生长速度下降,可完全抑制单核细胞增多性李斯特菌∞纠叩耐的繁殖弘“:从对天培的微生物研究结果可以看出,自然发酵过程中参与发酵的微生物种类繁杂,不同的豉生产的微生物进行分析,筛选符合制曲要求的微生物进行纯种发酵.同时对产品的微生物平安问题理应引起高度重视。不同产品的发酵微生物选择有各自不同的要求,如腐乳制曲时,霉菌是在蛋白质和油脂含量较高的豆腐块上生长,所以其发酵霉菌必须能大量分泌蛋白酶和脂肪酶;菌丝体必须为白色或黄白色以保证最终产品有吸引人的外观:菌丝体必须厚而密以在外表形成一层较巩固的膜,使腐乳块不易变形。同时霉菌不应有不良的气滋味或产生毒素¨“。少孢根霉那么是因其蛋白酶和脂肪酶产量高而被选为天培的主要生产菌种口〞。同时发酵微生物的生长特性会对生产工艺提出相应的要求,如少孢根霉不能在有皮的大豆上生长繁殖,所以天培生产时需先去皮口。而纳豆菌那么要求在湿度较高的条件下生产。尽管不同的产品对制曲微生物的要求各异,但通常应考虑以下几个方面:最终产品的颜色和风味:能生产足够的孢子:在固体培养物上能快速生长;对碳水化合物消耗不大;较高的酶活;遗传稳定性:不产生毒素四。..豆豉生产工艺及产品成分的研究豆豉生产包括原料处理、制曲和后发酵三大过程。其中原料处理』序包括浸泡、蒸煮,是为了给微生物生长提供一个有利的环境;制曲工序主要是依靠微生物产生降解大分子物质所需要的荇种酶,如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等:而后酵序那么是依靠微生物和酶的作用将大分子物质分解为小分子,如游离氨基酸、有机酸和醇类等,形成产品丰富的风味?。蔡位辉〞对大豆浸泡时温度与吸水率、浸泡液中九形物、水溶性蛋白和水溶性总糖含蕈的关系,以及蒸煮方式、蒸煮时间与蒸煮大豆中水溶性蟹白的关系进行了全面的研究,发现在。浸泡小时或℃浸泡小时后再在℃燕煮一分钟,所得蒸煮大豆的蛋白质变性中国农业大学博十论文绪论程度最正确,为豆豉制作的最住处理条件。杨军等对黑豆在不同浸泡温度到达最适含水量的时间,不同蒸煮条件下蛋白质变性程度等进行了研究,认为最适前处理条件为:。浸泡分钟,常压蒸煮分钟〞“。豆豉制曲过程,是以大豆作为培养基的微生物发酵过程,其影响因素有很多:优良菌种是提高发酵产率的前提.培养基成分是微生物生长和发酵产物形成的物质根底,发酵上艺参数的控制对发酵有重要的影响“〞。综合各方面的因素,制曲工序的目标包括以下儿个方面:①最大产酶量。②尽量保持酶的活性。③虽小程度利用原材料中的碳源,使后酵时碳源充足。④尽量防止菌种和制曲过程中的细菌污染。⑤最短的培养时间,节约水及能源“〞。。固态发酵过程中的主要艺参数有温度、值、湿度、时间和通气量等。豆豉中鲜味成分主要是游离氨基酸,尤其是游离谷氨酸;挥发性风味成分主要是呋哺类及芳香族的醛、醇类化合物,而纳豆挥发性风味成分中以吡嗪类化台物为主“。另外,豆豉营养丰富见表.,产品不仅含有较高的蛋白质、油脂和碳水化合物,而且含有丰富的矿物质和维生素。豆豉中蛋白质经酶解转化为可溶性蛋白、多肽及氨基酸后,消化率及生物价均有所提高,作为蛋白质水解度指标之一的氨基氮含量达...%或更高。表豆豉的营养成分〞’每.与国内对豆豉的研究相比,国外对天培和纳豆生产工艺的研究那么起步较早,研究了天培发酵过程中值的变化,结果说明天培发酵后值从蒸煮大豆的,增加到.以上,在发酵后期可检测出游离氨“。。;和御类似的结果?。;而等却报道了相反的结果,发现值从蒸煮大豆的.降到...“?。等发现大豆天培和蒸煮大豆的蛋白质含量没有明显的著别,但发酵后天培的蛋白质消化率从蒸煮大豆的?%提高到%左右;发酵过程中游离氮基酸的含量却增加了倍?:的研究结果说明火豆天培发酵过程中色氨酸含量大幅度增加〞?。等认为大培发酵过程中总氮减少,但游离氨基酸的含量明显增加?’。对少孢根霉生产天培的发酵过程中千物质、灰分、蛋白质、游离氨、粗脂肪、游离脂肪酸、甘油的含革以及蛋白酶和脂肪酶的活性进行了检测,在发酵早期即检测出了蛋白酶酶活和游离氨?。。考察了少孢根霉生产天培发酵过程中蛋白质的利用情况,发酵小时,有%的蛋白被水解,其中%以氨基酸或多肽的形式存在于天培中,%形成了菌丝体,另外%被氧化?。;外.天培发酵过程中各种酶的产生和酶活变化,维生素、腊肪和糖类等营养成分的含量变化部有八进行研究。儿乎纳豆中每种有益成分如纳豆激酶、多聚谷氨酸手维生素等,都被中国农业大学博士论文绪论作为研究对象,从产生该物质的菌种、相关的酶到生产艺对含量的影响及产物的性能都进行了分析。同国外对纳豆和天培的研究相比,国内对豆豉的研究落后了很多。首先是对发酵微生物研究不够,没有被广泛使用的优良菌株,所以研究非常分散:其次大局部研究仅将提高风味作为主要目的;再次是成分分析仅局限于成品,对微生物菌种、发酵条件对过程产品和最终产品成分的影响等没有进行研究分析。..豆豉生理功能的研究近年来欧美、日本对大豆及其发酵制品的功能性研究取得了很多成果。其中大局部功能与成人病的预防有关,包括预防癌症、脑堵塞、心肌堵塞、高血压、糖尿病等。通过对曲霉型豆豉原料、发酵微生物和工艺过程的分析,认为它可能拥有如功能:异黄酮的抗癌、抗氧化和糖尿病预防功能,多肽的降血压功能等,现对这些功能作如下简述。...异黄酮在加工过程中的变化及其对生理功能的影响常见食用植物仅大豆、葛根、苜蓿、三叶草中含有异黄酮类衍生物天然存在的异黄酮以葡萄糖苷和丙二酰葡萄糖苷为主要存在形式,其含量共占异黄酮?%,而苷元型和乙酰基糖苷型含量很少。干大豆中.黄豆苷和染料木苷占异黄酮总含量的%。糖苷型和苷元型异黄酮的结构式见图.和.。染料木苷::,:,:染料木素::,:黄豆苷::?,:?,::,:一黄豆素:罱弧图曝大豆中糖苷型异黄酮的结构式苷元型异黄酮的结构式曙吲.荡由Ⅶ憾耐髓脚大豆异黄酮在低浓度时表现为雌激素而在高浓度时那么表现为抗雌激素的作用,对妇女更年期出现的许多与激素减退相关的疾病如骨质疏松、动脉粥样硬化、血脂升高有一定的预防治疗作用。同时异黄酮还具有抗氧化性,可以降低癌症特别是乳腺癌和前列腺癌的发病率“〞。另外,因著名欧寿之乡冲绳县居民的异黄酮摄入量/天大大高于日本人平均摄入量./天,甚至有人认为大豆异黄酮是日本人长寿的秘密〞“。大豆的加工处理过程中,异黄酮会发生转型变化。等发现在大豆加工过程中,浸泡、蒸煮、碱处理、加热和脂肪酶的作用可使丙二酰葡萄糖苷和乙酰化的葡萄糖苷向糖莆型转化〞。〞’〞,认为挤压会使丙二酰异黄酮甙转化为乙二酰异黄酮甙¨〞;的研究结果说明,冷冻和冷冻枯燥都会使丙二酰异黄酮和糖苷型异黄酮的含量下降,蒸煮时异黄酮的变化与上述结果相似:但在所有这些加工过程中苷元型异黄酮的含量无明显变化。发现.葡萄糖苷酶可水解黄旦苷和染料木苷,而〞“发现中国农业大学博士论文绪论在豆酱制曲和后酵过程中有类似的转化。上述研究说明异黄酮由糖苷型转换为首元型必须有微生物或酶参与才能进行,常规处理如加热、挤压等无此作用。昔元型异黄酮为水不溶性,在大豆加二过程中不易流失。因此有许多关于用.葡萄糖苷酶或用.葡萄糖苷酶和脂肪酶生产大豆浓缩蛋白〞〞、大豆别离蛋白或富含异黄酮苷元的纤维产晶“的报道。异黄酮的形式不同,其消化吸收和生理活性也存在差异。〞。〞的研究说明黄豆素和染料木素在小鼠的胃部、小肠内均能够被吸收,而黄显苷和染料木苷仅在小肠末端可以被吸收。丙二二酰化和乙酰化的糖苷被大肠中的微生物降解为苷元等成分后才能被吸收“。在小肠中.对黄豆素和染料木素的吸收速度相当,但豆腐中异黄酮被吸收后,血液中主要以染料木素的形式存在.%,只有小局部以染料木苷.%和糖苷酸.%的形式存在。等〞的研究也证明小肠对染料木苷和染料木素的吸收是有差异的,吸收率分别为.%%。和认为这可能是因为糖苷型有较好的亲水性和较大的分子量的缘故【〞〞。证明染料木素和黄豆素在血浆中浓度到达峰值的时间分别为和小时,而其糖苷到达峰值的时间分别为和.小时?。苷元型异黄酮的功能性较糖苷型更强,如染料木素不仅是在所有异黄酮中抑制前列腺癌细胞生长最有效的物质,〞〞,还可减少乳腺癌的发生率【?,也是天培中具有抗氧化活性的主要物质【“。由此可见,异黄酮被葡萄糖苷酶从糖苷型分解为苷元型〞,可在减少异黄酮流失的同时,提高其在人体消化系统的吸收率,提高其生理活性,因此是提高大豆异黄酮利用率的一条有效途径。.心血管疾病的防治作用据不完全统计,年美国死亡人数中,%是由心血管疾病引起的,每个美国人中就有一人在其生命过程中受到心血管疾病的威胁。我国心血管疾病的死亡人数超过每年万人,高血压的患病率在成人中高达.%,且其可导致动脉硬化、心肌堵塞和肾病等疾病。多肽和蛋白质类激素是哺乳类动物体内四大类激素之一,血管紧张素是这类活性肽的典型例子.它具有调控血管的生理功能,是至今的活性最强的升血压肽。在血管紧张肽原酶~血管紧缩素体系中,羧端的?二肽被血管紧张索转换酶,切除后形成.抑制剂可有效抑制这种转换。其对高血压的预防或治疗机理如图.所示,由图可知,如果没有或降氏的活性,那么可减少的形成,从而预防血压升高。自年由〞〞首次从南美洲蝮蛇的毒液中发现来,已开发出一系列具有抑的活性肽,有的己仵为临床降压药使用。对高压患者可起到降压作用,对血压正常者无降压作用。,鼠,将纳豆、脱盐豆酱投入于饲料中喂养原发性高血压均发现不同程度的血压下降,而添加蒸熟大豆的对照组却无类似结果.推测可能是这些发酵豆制晶中存在着抑制的物质。继发现腐乳中存在降血压肽后,、和分别发现酱油【“、纳豆【和韩国豆酱也具有。韩国酱和酱油中的抑制物质已值见表类似的抑制效果,它们抑制%活一陛的浓度经过提纯,所以值较低,而纳豆中高分子量组分的抑制效果最好。肾素一血管紧张素系统激肢释放酶一激肽系统血管紧张素原肾素伊激肽释放酶激肽原?卜缓激肽?释放、前列腺素合成、心血管紧张素括性无活性血管扩张醛固酮释放血管紧张素缓释肽.钠排泄‘血管紧张剂’无活性钠储留血压上升图对血压的调节作用.表不同发酵豆制品中抑制成分及活性.产品韩国酱酱油日本纳豆..组分高分子量组分低分子量组分低分子量组分...////发酵大豆制品的降血压作用主要源于具有抑制活性的多肽,这类多肽分为三大类【:抑制型,与预混合保温后,值不变;底物型,被水解,抑制活性下降;前药型。要被或肠胃蛋白酶水解才能转化为真正的抑制剂。第一、三类被自然高血压鼠口服后仍表现出降血压功能,而底物型的应用价值不大。另外,大豆蛋白可以加强胆酸的分泌、影响内分泌系统进而改变与胆固醇代谢有关的激素的浓度,从而降低血清中的胆固醇和低密度脂蛋白的含量,从而可有效防止心脏病的发生【“。从纳豆中别离得到的纳豆激酶有强的溶血栓效果,有助于血管重新疏通¨。“。.糖屎病的防治作用糖尿病是发病率较高的文明病之一,主要是网为胰岛素缺乏而引起血糖过高,其并发症有因血糖不稳定而导致的视网膜病、神经病和肾病??。全世界的糖尿病患者达亿多,其中我国占万咀上,发病率占人口数的卜%,美国达?%,而我国岁以上的脑力劳动者更是高达%〞“。尽管糖尿病有种类型,不过非胰岛素依赖型糖尿病,型病人约占糖尿病病人总数的%,这类病人多数在饮食控制及口服降糖药治疗后可稳定控制血糖。口服降糖药主要包括磺脲类、双胍类、葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素分泌促进剂等。一葡萄糖苷酶抑制型药物如拜糖平、倍欣片是通过竞争性抑制小肠刷状缘的近腔上皮细胞内的。一葡萄糖苷酶,延缓二糖向单精的分解,阻碍小肠对葡萄糖的吸收,以降低餐后血糖水平,从而保持血糖的相对稳定。绪论中国农业大学博士论文年,【,〞发现黄酮对肠道的Ⅱ一葡萄糖苷酶酶活和糖的吸收有抑制效果,〞“证明大豆异黄酮中的染料木素也有此功能。通过饲养试验发现豆豉提取物,对小鼠肠内一葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性?“〞,一型糖尿病病人每餐餐前服用.的,个月后血液中葡萄糖的含量明显下降〞,这证明具有抗高血糖效果。同一课题小组的研究证明,非胰岛素依赖型糖尿病患者长期服用是平安的,没有任何副作用,因此对非胰岛素依赖型糖尿病有潜在的应用价值“〞。。..抗氧化功能人体内抗自由基损伤系统是一个可以与免疫系统相比较的,具有复杂而完善机能的系统。然而臭氧层的破坏,植物性食品摄入量的降低,会使人体内的自由基产生与去除平衡遭到破坏。自由基损伤细胞中的从而导致癌症的发生:破坏蛋白质可导致炎症和老年化;使脂质过氧化可导致动脉粥状硬化,进而发生中风或心脏病:破坏碳水化合物,使含在胶体内的透明质酸降解,从而导致关节炎渺?〞。酱和酱油具有抑制亚油酸氧化的作用,其抗氧化能力与成品中含氧量以及糖和氨基酸反响生成的类黑精有关,豆豉、天培中亦具有此类物质∞〞。在所有大豆发酵产品中,对天培的抗氧化活性研究最多。和等认为天培发酵过程中短芽孢杆和微杆菌菌、微球菌可将异黄酮转化为,,’一三羟基黄豆素和,,’一三羟基染料木素?’〞。,在亚油酸水溶液中它们是所有类异黄酮中活性最强的抗氧化剂〞?,其抗氧能力可与相媲美。等认为天培中抗氧化物质主要为酚类和氨基酸类,和异黄酮是天培中主要的酚类物质,天培的抗氧化效果可能是和发酵过程中产生的氨基酸的协同作用,在发酵过程中无变化,而异黄酮被水解为具有抗氧化性的苷元〞〞。。等,,发现大豆发酵制品中的抗氧化物质有:三羟基一一氮基苯甲酸“?,.一,,一和,二羟基苯甲酸“?,氨基葡糖及.羟基大豆素、.羟基染料木素和.羟基大豆素等?。随着发酵时间延长,天培的氧化稳定性增加。从上述研究结果可以发现,发酵大豆制品中的抗氧化物质主要为异黄酮类、氨基酸类和类黑素氨基葡糖。要提高产品的抗氧化功能应考虑此类物质的生成和转化。豆豉的生理功能早已为我们的祖先所利用,然而其具体的作用成分和作用机理尚不明确,因此具有潜在的研究意义。.存在的问题细菌型豆豉和根霉型豆豉在国外已得到深入的研究.且已经规模化、标准化生产,然而我国曲霉型显豉尽管生产历史悠久,但厂家分散,规模较、,生产还处于落后的手。作业阶段.靠经验操作,没有对技术改造提出更高的要求,对产品的研究没有引起重视。因向对曲霉型豆豉的研究存存下述问题:中孱农业大学博士论文绪论对发酵微生物及其发酵机理、生产工艺和产品的平安性等研究甚少。没有筛选出适宜的生产菌株,不能实现生产的工业化、标准化;对豆豉发酵过程中的成分变化,没有进行系统的研究,不了解发酵过程与豆豉营养、风味和功能间的关系;对豆豉生理功能的研究一直被无视,其机理至今尚不明确。。研究的内容和目标本课题是基于上述背景和我国豆豉的生产和研究现状提出的。主要目标是通过研究曲霉型豆豉发酵微生物和生产工艺.为产品的工业化提供理论依据:同时,对豆豉的功能性进行研究。探索其药用的理论根底,寻求新的开展方向,为大豆的深加工开拓新的应用途径。本课题的主要研究内容有:选取曲霉型豆豉产量最大的湖南浏阳一品香豆豉和天马山豆豉为研究对象,对自然发酵曲的发酵微生物进行分析,以确定主要的发酵微生物,并考察自然发酵豆豉的微生物安全性:大豆发酵产品的功能性成分主要与异黄酮和大豆蛋白有关,且游离氨基酸对风味的影响举足轻重,因此以各微生物的.葡萄糖苷酶和中性蛋白酶产酶能力为指标,从自然发酵豆豉曲中筛选出豆豉发酵菌株;根据筛选菌株的生长特性.按中心组合设计理论设计试验方案,测定不同发酵条件下曲中.葡萄糖苷酶和中性蛋白酶酶活,利用计算机软件对筛选菌株的纯种发酵制曲工艺进行优化,同时确定后酵条件:对纯种发酵产品的营养、风味和功能性成分进行分析,并同自然发酵豆豉进行对照,一方面检验筛选菌株是否适合豆豉生产,另一方面了解豆豉营养、风味和功能的物质根底;对豆豉的生理功能进行研究,主要研究其抗氧化性、降血压功能和降血糖功能,以自然发酵豆豉为对照,检验不同菌种纯种发酵对豆豉功能性的影响。中国农业大学博士论文第二章霉型豆豉曲中发酵微生物分布第二章曲霉型豆豉曲中发酵微生物分布.前言曲霉型豆豉几乎都是自然发酵生产,发酵过程难以控制,产品质量不稳定。为了控制发酵,实现生产的工业化,必须用纯种发酵代替自然发酵。无论是我国的酱油,还是日本的纳豆、豆酱和印尼的天培,都是在纯种发酵的前提下实现工业化的。自然发酵天培的主要发酵微生物为米根霉、少孢根霉等?,尽管米根霉、少根根霉和葡枝根霉也适于天培生产?““,但天培工业化生产的主要菌种为少孢根霉。为增加天培中的含量,常采用根霉和克氏肺炎菌混合发酵Ⅲ’?。在日本虽有很多曲霉菌曾被用于酱油的制备,实际应用的制曲菌种最终选择为米曲霉和瓷油曲霉〞。而纳豆生产的发酵菌株那么是单一的纳豆菌。与酱油、天培和纳豆从自然发酵向工业化开展的过程一样,要想实现豆豉生产的工业化,首先要了解自然发酵产品中的主要发酵微生物,然后才能从中筛选出适合发酵的菌株进行纯种发酵。曲霉型豆豉在我国分布最广,然而从报道资料和厂家调查的结果说明,对自然发酵的曲霉型豆豉的微生物分布至今没有进行过研究。测阳豆豉是曲霉型豆豉的优秀代表之一,浏阳豆豉以?品香豆豉和天马山豆豉最为著名,两者均为自然发酵产品,在同类产品中产量也最大,因此本课题选用一品香豆豉和天马山豆豉作为研究对象其生产工艺见图。考察了此两种豆豉曲中的微生物分布,确定了主要发酵微生物为曲霉菌;对曲霉菌进行别离.根据菌株在不同培养基上的菌落形态对曲霉菌进行初步分类,再选出各类中有代表性的菌株,根据菌株在不同培养基上的菌落形态,以及其菌丝形态、产孢结构和孢子的形态和尺寸对曲霉菌进行鉴定,为下一步菌种的筛选和应用打下根底;同时根据微生物的致病性和产毒能力判断产品的微生物平安性。.材料和方法..试验材料实验木料见表.表实验材料.中国农业大学博上论史第二章曲霉型豆豉曲中发酵微生物分布..仪器和设备实验仪器及设备见表.表实验仪器歪设备.仪器名称型号生产厂家各注电热鼓风枯燥箱型上海市实验仪器总厂低温培养箱/型重庆试验设各厂恒温水浴锅一型日本一光学显微镜重庆光学仪器厂附摄像系统.高压灭菌锅北京将台医疗设备厂无菌操作台北京半导体设备一厂摇床哈尔滨东联电子技术公司显微计数器一井内盛宋堂株式会社;本镜台测微尺重庆光学仪器厂目镜测微尺重庆光学仪器厂颇尔公司.过滤器..试验方法.豆豉曲样品中的微生物分布豆豉曲样品采集样品采集年月份在湖南浏阳市天马山豆豉。和一品香豆豉厂进行,用灭菌后的塑料包装袋从曲房中各取成曲左右,进行真空包装后置于℃冰箱保藏。样品处理分别取一品香和天马山豆豉曲样品,参加灭菌后的生理盐水加.%/吐温,浸泡分钟后摇匀,取上述液体注入灭菌后的试管中,在超净工作台中用灭菌生理盐水按倍比例逐级稀释到~。此样品稀释液用于细菌总数、酵母和耐盐酵母以及霉菌的科数。取样品液在沸水浴中煮分钟后冷却,再按:述步骤进行稀释后,用于芽孢菌计数。微生物计数细菌总数和芽孢菌第二章曲霉型豆豉曲中芨酵微生物分布中国农业大学博士论文用少量无菌生理盐水溶解,那它霉素,.%,/溶液配制:取那它霉素再在超净工作台中用.的微孔滤膜过滤,滤液滴入灭菌后的三角瓶中待用。培养基:营养琼脂培养基.,蒸馏水。搅拌均匀,。灭菌。冷却至?℃后,参加上述那它霉素溶液,以防霉菌和酵母的生长。涂布接种下的样品液将冷却后的培养基倒平板,待凝固后分别取稀释倍数为同,在培养箱中℃培养小时后进行细菌总数计数。取经灭菌处理后稀释倍数为?的样品液各.涂布接种,在。培养箱中培养小时后进行芽孢菌计数。酵母及耐盐酵母青霉素钠和链霉素溶液:取青霉素钠,参加灭菌生理盐水溶解;取链霉素微孔滤膜过,参加灭菌生理盐水溶解。在超净工作台中分别将上述两溶液用.滤,滤液滴入灭菌后的三角瓶中待用。培养基:土豆葡萄糖琼脂培养基,.:蒸馏水,丙酸钠,浓度/一℃灭菌。培养基冷却至.时,参加青霉素钠溶液和链霉素溶液各,使培养基中两者的浓度分别在?/和./范围内。将培养基用%的乳酸调至.?.,然后倒平测定耐盐酵母时在培养基中另参加,其余与酵母数测定相同。参加丙酸钠是为了防霉菌生长,参加青霉素钠和链霉素及调整是为了防止细菌繁殖。霉菌数培养基:虎红琼脂培养基.,蒸馏水。将上述培养基搅拌均匀,灭菌,冷却后倒平板。取一一加一的样品液.涂布于平皿中,在下培养小时后进行菌落计数。.样品中霉菌的别离察氏琼脂培养基:察氏琼脂培养基,蒸馏水,自然值.℃下灭菌。察氏酵母膏培养基:察氏琼脂培养基,酵母膏.,蒸馏水。自然值,℃下灭菌。在上述℃培养的霉菌接种平板中,挑取’培养皿中的各单独菌落,在另一倒有虎红琼脂培养基的培养皿中接种,再在℃培养?天后,取形态不同的单菌落再转接次,观察菌落形态,确定为单菌落后,分别接种于培养基、培养基和培养基,在。培养天后,根据在不同培养基中的菌落形态进行初步分类,曲霉被分为曲霉、、、和其他共大类,并按类计数,同时将所得菌种接种丁试管斜面培养基于℃冰箱中保存。曲霉菌的鉴定首丸根据菌株的菌落形态和菌丝形态,将别离得到的熵株中毛霉和曲霉区分开,然厉按中国农业大学博士论文第一章曲霉型显豉曲中技酵微生物分布曲霉在、和培养基上的菌落形态对其进行初步分类,最后按类别取有代表性的菌株、、和进行鉴定。菌丝体形态观察麦芽汁琼脂培养基:麦芽汁粉,琼脂,蒸馏水,调至.?.后,在℃卜灭菌。其余同前。将别离后菌落形态不同的菌株,分别接种于不同的培养基,并分别在不同的温度下培养,以观察其菌落形态。具体步骤为:在倒好培养基平皿中,用接种针从斜面挑取少许孢子在培养皿中按三角形顶点位置三点