代谢工程-周奕腾改+试卷

11级真题试卷代谢工程:利用基因工程技术,有目的地对细胞代谢途径进展准确的修饰、改造或扩展、构建的代谢途径,以转变生物体原有代谢特性,并与基因调控、代谢调控及生化工程相结合,提高目的代谢产物活性或产量、或合成的代谢产物的工程技术科学。1,这两种技术有助于代谢工程的分析方面蛋白质工程,合成生物学,有助于代谢工程的基因操作方面.三大代谢途径：糖酵解EM、三羧酸循环TCA、磷酸戊糖途径HM〕或称PPP两个应用实例：A、添加物导致代谢途径酶活加强：加维生素增加了磷酸果糖激酶活性和乳酸脱氢酶活性，增加了乳酸的生产B、参加葡萄糖酸钙能促进高6一磷酸葡萄糖脱氢酶和葡萄糖激酶的酶活力，促进了肌苷的合成4、酶调整方式、反响调整方式：5、5、转录的功能单位。以及调整基因的整个DNA子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等6、分支代谢调整途径：同功酶调节：催化一样反响，但酶分子构造有差异；协同反响抑制：一个不能少；累积反响抑制：按比例累加，无协同效应，无拮抗作用；D.增效反响抑制：1+1>2(末端产物Y和ZE1产物过量并不影响其他末端产物的形成。只有当YZ同时过量，才能对E1制作用。)E.挨次反响抑制：按①→②→③挨次逐步抑制；F.联合激活或抑制调整：途径产物各自调整，同一中间产物；7、会计算累积反响抑制〔60%，20%，68%〕8、不同谷氨酸生产菌的两大特征：α-酮戊二酸脱氢酶的缺乏;对生物素的需要(生物素缺陷型)9、代谢流(物流/通量)(flux)指流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。10、代谢流分析(metabolicfluxanalysis)：又称代谢通量分析，一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。11、代谢设计原理：提高通向目标产物的代谢流；扩展代谢途径；构建的代谢途径12、代谢工程争论的根本程序：改进靶点确实定；基因操作；效果分析13、基因操作：基因过量表达，基因敲除，异源基因导入14、四大组学：基因组学与比较基因组学；转录组学；蛋白质组学；代谢组学15、英文简称：LC：液相色谱；GC：气相色谱；GC-MS：气质联用仪；NMR：核磁共振；HPLC:高效液相色谱；CE：毛细管电泳；2-DE：双向凝胶电泳；DIMS：直接注射质谱；FT-IR：傅立叶转换红外色谱；IEF：等电聚焦；ESI—MS：电喷雾质谱；RI：示差折光检测法；UV：紫外检测法；了解基因的功能、表达调控机制和物种进化过程的学科。16、代谢工程的根本争论思路环。17得到的结论，统称为代谢通量分析18、代谢通量计算〔入为+，出为—〕18、AX(t)=0假设方程数小于反响速率数目〔代谢通量假设方程数大于反响速率数目，称为超定系统。19的途径。20、设计育种以及发酵工艺掌握的的五字策略：“进、通、节、堵、出”①进，促进细胞对碳源养分物质的吸取；②通，使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物；产物；④堵，消退或减弱目的产物进一步代谢的途径；⑤出，促进目的产物向胞外空间分泌。21的一些点〔代谢物。着终产物的得率，这些节点称为主节点。着终产物的得率，这些节点称为主节点。节点的安排比：节点输出途径的代谢流的比值。22、柔性节点：假设流入每一分支的流量简洁转变以满足需求，这样的节点称为柔性节点(flexiblenode)。刚性节点：假设一个节点的一个或多个分支的安排率被严密掌握，则称该节点是强刚性的。半柔性〔弱刚性〕节点：假设在一个节点的流量安排，由它的一个分支的动力学占优势，则称该节点是半柔性〔弱刚性〕节点。23、会推断〔柔性节点，安排比可变，总量一样。刚性节点安排比不变，比例一样〕112刚性：减弱B11PB2P12柔性：减弱B11PB2,P假设节点1或节点2为刚性时，B1增大，P1增大，P2减小。分3种状况增加的＞削减的，P增加的＜削减的，P增加的≈削减的，P24、13CMFA原理与方法：利用同位素标记底物及NMR或GC-MS(气相色谱-质谱仪)分冗余能更加准确地估算未知通量1)〔拟〕稳态假设是MFA的重要前提。代谢稳态和同位素平衡状态标记底物的选择必需慎重考虑。要合理设计标记底物组合方式以获得最大通量信息。为降低试验中底物用量方面的花费，生物反响器容积应尽量小。但反响器容积太小系统的稳定条件便很难到达。因此目前使用的生物反响器容积通常在300-1000mL。25、作为运载体必需具备哪些条件？能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。具有某些标记基因，便于进展筛选。如抗菌素的抗性基因26、基因操作的根本步骤：1、目的基因的猎取；2、基因表达载体的构建；3、将目的基因导入受体细胞；4、目的基因的检测与鉴定27、猎取目的基因的常用方法有哪些?〔1〕从基因文库中猎取〔2〕PCR技术扩增〔3〕人工合成。。目的基因主要是指编码蛋白质的构造基因28、利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为聚合酶链式反响，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②原理：DNA复制③条件：基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、一对引物(做启动子)、DNA聚合酶.前提条件：2^n〔n为扩增循环的次数〕⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。2PCR〔高温〕〔低温〕〔适温〕延长30、同源重组〔英语：Homologousrecombination〕是遗传重组的一种类型，指两股具有相像序列的DNA的重排列，使遗传物质发生交换。可发生于自然界中，或应用于人工的分子生物学技术。31、非同源重组又包括位点专一重组和格外规重组。32、生物转化与组合生物转化。论述题1、以大肠杆菌为宿主构建乙醇代谢工程生产菌和以酿酒酵母为宿主构建乙醇代谢工程生产菌各有什么优缺点？大肠杆菌优点：1〕底物谱宽，可以在廉价培育基上生长，含有木糖代谢基因，可以利用木糖〔2〕高密度培育，生长速率快；大肠杆菌的生理和遗传背景清楚，有利于简单遗传操作。在好氧和无氧条件下均能产生乙醇。〔〕代谢副产物简单，比方产生乙酸等副产物〔2〕对产物乙醇的耐受力量低，不利于积存高浓度乙醇。酵母优点：厌氧生产乙醇时，代谢副产物少，对乙醇的耐受力量高，有利于积存高浓度乙醇。适合高密度培育。缺点：底物谱不够宽，常用的酿酒酵母以粮食为原料，高产乙醇但是不能利用木糖，也就不困难：把其它菌的木糖异构酶基因导入到酿酒酵母，比方E.coliB.subtilis的木糖异构酶基因，但都没有成功，有肯定难度。2、谷氨酸棒杆菌中色氨酸的生物合成途径和代谢调整机制如图3所示。试述色氨酸工程菌株的代谢设计策略。图3 谷氨酸棒杆菌中色氨酸生物合成途径及其代谢调整机制〔代谢途径描述：谷氨酸棒杆菌中色氨酸的生物合成途径和代谢调整机制如下图。在谷氨酸棒杆菌EMP途径和HMP途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)4-磷酸赤藓糖(EP)，两者在DAHP合成酶(DS)3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP经三步酶促反响生成莽草酸，莽草酸经三步酶促反响生成分支酸。由(AS)催化下合成邻氨基苯甲酸，邻氨基苯甲酸在邻氨基苯甲酸磷酸核糖移换酶(PRT)、色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸变位酶(CM)的催化下生成预苯酸(PPA)。由(PD)酪氨酸；在预苯酸脱水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最终合成苯丙氨酸。在分支酸〕〔1〕加速限速反响PEP和EP的支路代谢，解除苯丙氨酸和酪氨酸对DS的反响调整，增加分支酸的浓度等方法。为了积存更多的PEP丙酮酸激酶活力低的菌株或者选育硫辛酸和硫胺素(分别为丙酮酸脱羧酶系和丙酮酸羧化酶系的辅酶)双重缺陷突变株。将编码限速酶的基因通过基因扩增，增加拷贝数拷贝数的载体上再导入宿主中去表达DS酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA等。trpE、trpD、trpC、trpB、trpA这五种构造基因集中在DNA将与色氨酸合成有关的基因克隆到质粒pDTS9901BPS-13,在500ml培育基中3035.2g/〔亲株产20.1g/。争论觉察，假设使大肠杆菌中色氨酸操纵子中的弱化子缺失，则trp基因表达量可提高六倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样〔即无论trpR或trpR会提高色氨酸的产量。转变分支代谢途径流向提高代谢分支点某一分支代谢途径的酶活力酸和苯丙氨酸三条支路上的任何一条支路的酶活性被加强DS基因克隆到谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamiu中，构建精彩氨酸工程菌，它促使了Trp支路第一个产物氨茴酸AntTrp对该质粒所编码的Ant合成酶和Ant磷酸核糖基转移酶的反响抑制，结果色氨酸产量达43g/L。假设再将苯丙氨酸合成相关的酶基因如pheA基因敲除，则可使色氨酸产生菌产酸达50g/L。另外，切断由分支酸到预苯酸、VK、CoQ的代谢支路，可节约碳源，使中间产物分支酸更多地DS而有利于色氨酸积存。具体可承受构建预苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、酪氨酸缺陷、VK缺陷、CoQ缺陷等代谢改造措施。据报道，有人以谷氨酸棒杆菌为动身菌株，经代谢改造得到的KY9456(Phe-+Tyr-)L-0.15g/L。这个产量是很低的，由此也可看出只构建缺陷型是不够的，还必需解除由色氨酸引起的反响调整。AS酶缺陷的回复突变株，可增加色氨酸的积存。由于当