第四章食品安全性评价基本方法课件

第四章

食品安全评价基本方法第四章

食品安全评价基本方法本章内容概述11.急性毒性试验及其评价2.亚慢性和慢性毒性试验及其评价3.遗传毒性试验4.致癌试验5.生殖发育试验本章内容概述11.急性毒性试验及其评价第一节急性毒性试验及其评价急性毒性试验概述急性毒性试验的目的急性毒性试验的主要参数急性毒性的试验方法急性毒性试验结果评价本节内容第一节急性毒性试验及其评价急性毒性试验概述急性毒性试验的第一节急性毒性试验及其评价一、急性毒性试验概述1.定义（1）指机体（人或试验动物）一次接触或24h内多次接触化学物后在短期内（最长到14d）所发生的毒性效应。（2）一次接触经口和注射接触，“一次”指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内；经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”指在一个特定期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程第一节急性毒性试验及其评价一、急性毒性试验概述经口和注射第一节急性毒性试验及其评价确定急性毒性评价参数找出剂量-效应剂量-反应关系试验目的AB为毒作用机制研究提供线索D为后续试验的剂量和观察指标选择提供依据C二、急性毒性试验的试验目的第一节急性毒性试验及其评价确定急性毒找出剂量-效应试验目第一节急性毒性试验及其评价三、急性毒性试验的主要参数第一节急性毒性试验及其评价三、急性毒性试验的主要参数第一节急性毒性试验及其评价三、急性毒性试验的主要参数1.ED50与EC50（半数效应剂量或浓度）指一次给予实验动物某种化学物质引起动物群体中50%个体出现某种特殊效应的剂量。2.ATE（急性毒性估计值）同一受试物在不同实验室、不同动物之间，或在重复实验中获得的LD50值有很大差异对某些低毒或剧毒物质没必要准确确定LD50（LC50）便可对受试物毒性分级处于动物福利观念和节约资金、资源、时间和人力的观念。第一节急性毒性试验及其评价三、急性毒性试验的主要参数第一节急性毒性试验及其评价1234以死亡和死亡率作为试验终点和急性毒性的评定参数；可以获得剂量-效应/反应曲线、曲线的斜率、LD50及其可信限等重要参数；实验动物用量大；是一种体内试验方法。四、急性毒性试验的试验方法1.经典急性毒性试验的特点第一节急性毒性试验及其评价1234以死亡和死可以获得剂实第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法2.实验动物（1）动物物种选择原则：实验动物接触受试物的毒性反应与

人类基本一致，并且对受试物最敏感两种实验动物：啮齿类动物：大鼠、小鼠、豚鼠、兔非啮齿类动物：狗、猴第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法啮齿第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法2.实验动物（2）动物品系的选择大鼠品系为SD（sprague-dawley）和Wistar大鼠

小鼠品系为昆明种、NIH和ICR（3）性别和年龄的选择

一般雌雄各半

一般选择初成年者动物体重动物体重动物体重大鼠180~240g家兔2~2.5kg犬10~12kg小鼠18~25g豚鼠200~250g猫1.5~2kg第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法动物第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法2.实验动物（4）实验动物数量和分组一般分5~7组，大、小鼠不少于10只，家兔不少于8只，犬不少于6只

分组遵循随机原则（5）动物饲养和管理

动物在实验前应有1~2周检疫观察期

适应饲料和环境3~5d

染毒前禁食、空腹，大鼠和大型动物隔夜禁食，小鼠禁食4h左右，染毒后禁食2~4h。饮水不限。第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法第一节急性毒性试验及其评价急性毒性试验的试验方法3.受试物处理和染毒途径（2）染毒途径

经口染毒

经呼吸道染毒经皮肤染毒经注射染毒

染毒途径第一节急性毒性试验及其评价急性毒性试验的试验方法经口第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法5.试验周期14天为宜6.毒性观察中毒症状死亡时间和数量动物体重变化病理学检查其他指标第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法7.试验设计与LD50计算常用方法改良寇氏法方法1霍恩氏法方法2威尔氏法方法3概率单位法方法4第一节急性毒性试验及其评价四、急性毒性试验的试验方法常用第一节急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价1.分级标准第一节急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价第二节急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价1.分级标准我国工业毒物急性毒性分级标准急性毒性分级小鼠1次经口LD50/（mg/kg）小鼠吸入2hLC50/（mg/m3）兔经皮LD50/（mg/kg）剧毒＜10＜50＜10高毒11~10051~50011~50中等毒101~1000501~500051~500低毒1001~100005001~50000501~5000微毒＞10000＞50000＞5001第二节急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价急性毒第二节急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价1.分级标准我国农药急性毒性分级标准毒性分级经口LD50/(mg/kg)经皮LD50/(mg/kg)，4h吸入LD50/(mg/m3)，2h剧毒＜5＜20＜20高毒5~5020~20020~200中等毒50~500200~2000200~2000低毒＞500＞2000＞2000第二节急性毒性试验及其评价五、急性毒性试验结果评价我国农第二节亚慢性和慢性毒性试验及其结果评价

亚慢性和慢性毒性试验概述亚慢性和慢性毒性试验的目的亚慢性和慢性毒性试验的方法亚慢性和慢性毒性试验结果评价1234本节内容第二节亚慢性和慢性毒性试验及其结果评价亚慢性和慢性毒第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性毒性试验1.定义：指人或实验动物连续较长时间接触较大剂量的外源化学物所引起的毒性效应。2.持续时间：实验动物寿命的1/30~1/10，一般为3个月。3.剂量与染毒：上限剂量＜LD50，每次染毒剂量及染毒时间相等。二、慢性毒性试验1.定义：指实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。2.持续时间：啮齿类动物生命周期的绝大部分时间或终生。3.举例：小鼠18个月，大鼠24个月，其他动物一般为2年，特殊情况可长达7~10年。概述第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性毒性试验二、慢第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性和慢性毒性试验的目的1确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性毒性试验中发现的毒作用提供新信息，并发现以往未发现的毒作用2研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官3研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量-反应（效应）关系，确定其LOAEL和NOAEL，提出安全限量参考值第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性和慢性毒性试验第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性和慢性毒性试验的目的4研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性5亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标的选择提供依据6确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价一、亚慢性和慢性毒性试验第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法1.实验动物的选择2.染毒途径3.剂量选择与分组4.观察指标一般指标生理生化指标病理学检查特异性指标中毒症状动物体重食物利用率尸检脏器系数组织学检查第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法一第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法1.实验动物的选择（1）种系选择（2）性别：一般雌雄各半（3）年龄小鼠15g左右，大鼠100g左右组内体重差不超过平均体重的10%;

组间体重差不超过平均体重的5%（4）数量小动物每组不少于20只，大动物每组6~8只试验中期如果要处死动物则要相应增加数量啮齿类动物非啮齿类动物：犬——Beagle犬小白鼠：昆明种、NIH或ICR大白鼠：Wistar、SD第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法啮第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法2.染毒途径（1）选择原则（2）经口染毒饲喂法：每日染毒，连续给予，定时定量灌胃和胶囊吞咽法：适用于有异味、易挥发、易水解、易氧化的受试物（1）尽量模拟人类在环境中接触化合

物的途径或方式（2）与预期进行慢性毒性试验的接触

途径相一致第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法（第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法3.剂量选择与分组（1）试验设组高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白对照组（2）剂量设计原则高剂量组在试验期内既不发生死亡，又能引起明显的毒性反应，或仅有个别动物死亡（＜10%）中剂量组为观察到最小损害作用剂量（LOAEL）低剂量组为未观察到损害作用剂量（NOAEL）第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法3.剂量选择与分组（3）剂量设计依据高剂量组：急性毒性试验的阈剂量，或LD50的1/20~1/5中、低剂量组：以3~10倍公比等比设计3组剂量一般适宜设计范围为LD50的1/10~1/80之间做等比设计第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标（1）一般指标中毒症状：每日观察实验动物出现的行为改变和客观征象的异常，出现的时间和先后次序动物体重：每周称重，在上午的同一时间进行；观察各组间差异是否有剂量-反应关系食物利用率定义：动物每食入100g饲料所增加的体重克数。若干扰物质吸收代谢，则食物利用率↓，体重↓；若不适口而降低食欲，则食物利用率不变，体重↓第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标（2）生理生化指标血常规：红细胞数（RBC）、白细胞数（WBC）、血红蛋白量（Hb）、红细胞压积容量（PCV）、白细胞分类数（DC）、血凝时间血液生化指标：血清总蛋白（TG）、白蛋白（ALB）、血糖（GLU）、血清尿素氮（BUN）、总胆红素（T-BIL）、肌酐（Crea）、总胆固醇（T-CHO）、总甘油三酯（TG）、LDL、VLDL、HDL、谷丙转氨酶（SGPT）、谷草转氨酶（SGOT）、碱性磷酸酶（ALP）等尿指标：外观、pH值、尿蛋白、尿糖、尿潜血等第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标（3）病理学检查尸检脏器系数定义：又称脏/体比值，指某个脏器湿重在每100g体重中所占的质量。举例：肝/体比，即（全肝湿重/体重）×100

意义：增加则表明有充血、水肿、增生、肥大等减小则表明出现萎缩、退行性变化等组织学检查第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法4.观察指标（4）特异指标定义：指受试物对机体亚慢性毒性作用本质的特征性指标。获得方法（1）分析急性毒作用特征，初步发现主要危害的组织系统或靶器官，从而发现敏感或特异的指标（2）进行文献检索，参考一些化学物的某些特殊基团具有的特定毒性，利用其化学结构中的共性来选择亚慢性毒性指标第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价二、亚慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法实验动物的选择染毒途径剂量选择与分组观察指标1234第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法实验第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法1.实验动物的选择（1）种系选择啮齿类首选大鼠，非啮齿类选犬和猴（2）性别：一般雌雄各半（3）年龄大鼠和小鼠为初断奶者小鼠3w，10~12g；大鼠3~4w，50~70g；犬4~6month（4）数量每组小动物≥40只，大动物≥8只第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法2.染毒途径与人类接触途径相似，一般采用经口喂饲方法3.剂量设计与分组慢性毒性试验剂量设计参考值参考剂量名称亚慢性阈剂量LD50MTD高剂量1/5~1/21/101/2中剂量1/50~1/101/1001/4低剂量1/1001/1000_第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法参考第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法4.观察指标（1）以亚慢性毒性试验的观察指标为基础，优先采用亚慢性毒性试验筛选出来的敏感、特异指标。（2）注意试验前对预计观察指标，尤其是生理生化指标进行正常值测定，废弃个体差异大的动物试验期间进行动态观察的各项指标应与对照组同步测定所采用的各种化验方法应精确、可靠，且进行质量控制（3）了解毒性反应的可逆程度第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价三、慢性毒性试验方法第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价四、亚慢性和慢性毒性试验结果评价1.亚慢性毒性评价试验中最敏感指标的NOAEL和LOAEL（1）NOAEL小于人的可能摄入量的100倍，表示毒性较强，应予放弃；（2）NOAEL大于100倍而小于300倍，继续进行慢性毒性试验；（3）NOAEL大于或等于300倍者，不必进行慢性试验，直接进行毒性评价。第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价四、亚慢性和慢性毒性试验第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价四、亚慢性和慢性毒性试验结果评价2.慢性毒性评价试验中最敏感指标的NOAEL和LOAEL。计算慢性毒性作用带（Zch）（1）NOAEL小于或等于人群的可能摄入量的50倍者，表示毒性较强，应予放弃；（2）NOAEL大于50倍而小于100倍，需相关专家共同评议是否用于食品；（3）NOAEL大于或等于100倍者，则予考虑允许使用于食品，并制定卫生标准。第二节亚慢性和慢性毒性作用和评价四、亚慢性和慢性毒性试验第三节食品中化学物质的致突变作用及评价12概述致突变作用的类型致突变作用的机制及后果致突变作用的评价方法4321第三节食品中化学物质的致突变作用及评价12概述致突变作用的致突变作用的评价方法一、观察项目的选择1.观察的效应终点类型遗传学终点的分类基因突变染色体畸变DNA损伤等其他遗传损伤的检测致突变作用的评价方法一、观察项目的选择致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法微生物试验哺乳动物细胞基因突变试验果蝇伴性隐性致死试验转基因动物突变试验鼠伤寒沙门菌/组氨酸回复突变试验（Ames试验）大肠杆菌WP2回复突变试验酵母菌正向/回复突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验微生物试验鼠伤寒沙门致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——Ames试验指示微生物：鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷突变株原理：利用若干不同基因型的组氨酸缺陷型菌株，每个菌株具有其独特的回复突变“靶点”顺序，可以由不同类型的碱基置换和移码诱变剂诱发回复突变。鼠伤寒沙门氏菌原养型（his+）正向突变回复突变组氨酸营养缺陷性突变株（his-）受试物±代谢活化系统致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验鼠伤寒沙门氏菌原养型致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——Ames试验这组检测菌株含有下列突变：①组氨酸基因突变②脂多糖屏障丢失（rfa）：大分子待测物能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受影响③紫外线切除修复系统缺失（ΔuvrB）：紫外线照射后不能生长④抗药性标记R：某些菌株具有抗氨苄青霉素的质粒，提高检出的灵敏性，假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，则具有pAQI质粒。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——Ames试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——Ames试验活化系统——S9混合液

①将一组雄性大鼠进行腹腔注射芳香族化合物（如多氯联苯）油溶液等，以诱导肝脏酶系的活性，4d后杀鼠取肝脏。

②匀浆后9000g离心，所得的上清液（S9）加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子即制成。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——Ames试验优点

方法灵敏，检出率高，有约90%的化学致癌物都可获得阳性结果；方法简便、易行，不需特殊器材，容易推广。缺点

微生物的DNA修复系统比哺乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——大肠杆菌WP2回复突变试验指示微生物：大肠杆菌的色氨酸缺陷型菌株原理：与Ames试验相似检测诱变剂类型：碱基替换特点：WP2pKM101所能检测的诱变剂能够覆盖大量的TA102特异诱变剂；WP2uurA/pKM101在诱变性检测上具有与TA102一致敏感性，且对丙烯酸酯类衍生物和氯乙酸酯类衍生物的遗传毒性检测具有特异性。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑴微生物试验——酵母菌正向/回复突变试验可检测的类型：正向突变、回复突变、有丝分裂重组和非整倍体4种类型缺点：很多具有遗传毒性的分子不能透过酵母菌的细胞膜，而不能达到DNA靶分子酵母的ADE1、ADE2菌株少量腺嘌呤的培养基白色菌落酵母的ADE1、ADE2突变菌株少量腺嘌呤的培养基红色菌落嘌呤生物合成阻滞致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验酵母的ADE1、AD致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑵哺乳动物细胞基因突变试验试验原理（如右图）突变频率：指观察到的突变细胞数与存活细胞数的比值。常用的试验方法①小鼠淋巴瘤（L5178Y）细胞苷激酶位点（TK）突变检测②中国仓鼠卵巢（CHO）细胞及中国仓鼠肺（V79）细胞次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点（HGPRT）突变检测细胞+受试物代谢活化系统细胞传代6-TG或TFT形成集落未形成集落计算突变频率以评价受试物的致突变性6-TG：6-硫代鸟嘌呤；TFT：三氟胸腺致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验细胞+受试物代谢活细致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑵哺乳动物细胞基因突变试验TK基因

位于常染色体TK基因位点突变可反映HGPRT基因

位于X染色体，半合子状态，能被必需的基因隐蔽应用受限：大范围的缺失、同源有丝分裂重组、染色体断裂和数目改变一般不表现出突变克隆增加基因突变基因缺失基因转变基因易位有丝分裂重组致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验基因突变致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑶果蝇伴性隐性致死试验优点：果蝇体内对化学物的生物转化能力与哺乳动物相似，世代周期短、繁殖率高、饲养方便、经济、判断突变终点客观、不需活化等。缺点：与哺乳动物差异较大，染毒方式与剂量计算等都与哺乳动物试验不同。结果判定：阴性结果判定和外推要要慎重致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑶果蝇伴性隐性致死试验原理：①隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传性，即雄蝇的X染色体传给F1代雌蝇，又通过F1代传给F2代雄蝇。②位于X染色体上的隐性基因能在半合型情况下于雄蝇中表现出来。③利用眼色性状由X染色体上的基因决定，并与X染色体的遗传相关联的特征来作为观察在X染色体上基因突变的标记，以野生型雄蝇（红色圆眼）染毒，与Basc（Muller-5）雌蝇（淡杏色棒眼）交配。有隐性致死时，在F2代中没有红色圆眼的雄蝇。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验1.基因突变检测方法⑷转基因动物致突变检测转基因动物：指基因组中整合有用实验方法导入的DNA，并能遗传给后代的一类动物。常用动物：BigBlue小鼠，以大肠杆菌LacI为靶基因；Muta-Mouse小鼠，以大肠杆菌LacZ为靶基因试验方法：染毒后先抽提不同器官或组织的基因组DNA，然后把纯化的基因组DNA与噬菌体体外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中。用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑴染色体畸变分析试验啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验体内试验体外试验CHO中国仓鼠卵巢细胞CHL中国仓鼠肺细胞V97细胞外周血淋巴细胞致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验啮齿类动物骨髓细胞染致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑵微核试验（MNT）微核：染色体的断片或者整条染色体在细胞分裂过程中未按正常程序进入细胞核而滞留在细胞质中的染色质小题。来源①断片或无着丝粒染色体环在细胞分裂后期不能定向移动，遗留在细胞质中②有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑵微核试验（MNT）微核试验：通过观察受试物能够产生微核，并检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂的试验。用于检测的细胞植物细胞哺乳类动物细胞非哺乳类动物细胞紫露草花粉母细胞蚕豆根尖鱼红细胞蟾蜍红细胞骨髓细胞、肝细胞脾细胞、淋巴细胞红细胞致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验植物细胞紫露草花粉母致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑵微核试验（MNT）体内试验：啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验成红细胞排出主核多染红细胞（PCE）保持嗜碱性24h正染红细胞（NCE）外周血微核留在胞浆中致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验成红细胞排出主核多染致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑵微核试验（MNT）啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验剂量及分组实验动物选择：每组8只，雌雄各半试验过程：染毒、处死、取骨髓、涂片、固定、染色后，每鼠计数1000个PCE的微核细胞率高剂量组：LD50/7的80%低剂量组：LD50/7的40%阴性对照组阳性对照组（环磷酰胺）注：LD50/7为在7d使50%动物死亡的剂量致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验高剂量组：LD50/致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑵微核试验（MNT）体外试验：细胞质分裂阻断法微核试验新进展：利用流式细胞仪和图像分析系统进行自动化微核检测PBCCHLCHOV79细胞染毒培养后期细胞松弛素B双核细胞微核试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验PBC细胞染毒细胞松致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑶显性致死试验显性致死突变：指生殖细胞染色体发生结构和数目异常的遗传学损伤，此种损伤不影响受精，但可导致受精卵在着床前死亡或胚胎的早期死亡。剂量及分组三个处理组：最高剂量为LD50的1/10~1/3阴性对照组阳性对照组致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验三个处理组：最高剂量致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.染色体畸变试验⑶显性致死试验试验方法（右图）结果分析雄鼠一次或连续5d每天染毒一次染毒后1~2d开始交配雄:雌=1:2，同笼5d休息2d雄:雌=1:2，同笼5d交配如此循环小鼠6~8w大鼠8~10w将雌鼠于同笼第3d起的第13~14d处死，检查宫内的着床数、早死胎、晚死胎、活胎数1~3w对精子、精细胞有毒性作用4~5w对精母细胞有毒性作用6w~对精源细胞有毒性作用致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验雄鼠一次或连续5d每致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验3.其他DNA损伤的检测⑴DNA链断裂①单细胞凝胶电泳（SCGE）原理细胞+受试物细胞裂解液细胞膜破坏胞质内蛋白质等成分进入凝胶→裂解液核内DNA附着在剩余的核骨架上→留在原位解旋DNA电泳DNA未损伤→DNA停留在核基质中→圆形荧光团无拖尾DNA损伤→DNA断片多→小分子量DNA进入凝胶向阳极泳动→亮的头部和尾部→形似彗星致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验细胞+细胞裂解液细胞致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验3.其他DNA损伤的检测⑴DNA链断裂①单细胞凝胶电泳（SCGE）结果分析

损伤越严重，断片越多、越小，迁移DNA量越大，迁移距离越长，尾长和尾部荧光强度增加。试验优点

检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的细胞数要求少，操作简便、费用低。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验3.其他DNA损伤的检测⑵DNA加合物的检测——32P后标记法原理①含有加合物的DNA链在内外切酶的作用下降解为3’单磷酸核苷；②通过消除正常的核苷酸来富集加合的核苷酸；③在特异的T4多核苷酸激酶的作用下，将具有高度特异活性的32P-ATP的磷酸根基团转移到加合物的核苷酸的5’-羟基末端，使其形成3’-5’二磷酸核苷；④将标记的加合物通过薄层层析技术分离；⑤放射自显影定量分析。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验3.其他DNA损伤的检测⑵DNA加合物的检测——32P后标记法优点灵敏度高，达到1个加合物/1010个核苷酸的水平；DNA需样量小1~10μg不需事先制备加合物标样，用空白对照可定量计算加合物含量可用于单一加合物检测、复杂混合物测定，以及未知内源性亲电性物质形成的加合物致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验2.其他DNA损伤的检测⑵DNA加合物的检测——32P后标记法缺点特异性差；步骤多；稳定性不易掌握；不同实验室所测定的结果差别很大；不能明确地识别单个加合物类型，以及确定加合物的化学结构。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验

3.其他DNA损伤的检测

⑶DNA加合物的检测——免疫学方法原理：抗原抗体反应，有多克隆抗体检测和单克隆抗体检测方法：竞争放射免疫法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫吸附法（RIST）、超敏酶促放射免疫法（USERI-A）优点灵敏度高，1个加合物/107~8核苷酸；不需酶解DNA链；用免疫沉淀技术可以将有加合物的链与无加合物的链分离，简便易行、经济。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验

3.其他DNA损伤的检测⑶DNA加合物的检测——免疫学方法缺点制备抗体的过程复杂；特异抗体可能与结构相似的化合物发生交叉反应；DNA的需求量大，25~60μg；对非抗原性加合物和未知抗原加合物的检测无能为力。

⑷DNA加合物的检测——其他方法荧光测定法；色谱-质谱法；核磁共振法；碱洗脱法；序列测定法等致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验荧光测定法；色谱-质致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验

3.其他DNA损伤的检测

⑸DNA修复的检测——非程序性DNA合成试验（UDS）程序性DNA合成

正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行DNA复制合成，成为程序性DNA合成。非程序性DNA合成

DNA受到化学损伤后，细胞启动损伤的修复过程，这一过程将合成一条较短的DNA新链，此修复称为“程序外DNA合成”。致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验

3.其他DNA损伤的检测

⑸DNA修复的检测——非程序性DNA合成试验（UDS）试验原理缺点

不掺入新核苷酸的DNA损伤

修复类型无法测出将细胞阻断于G1期阻断DNA半保留复制细胞受试物3H-胸腺嘧啶核苷如果DNA损伤则3H-胸腺嘧啶核苷掺入DNA链放射自显影法或液闪计数法测定DNA的放射活性致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验将细胞阻断于G1期细致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验

3.其他DNA损伤的检测

⑹姐妹染色单体交换试验致突变作用的评价方法二、主要的致突变试验第四节化学致癌作用的评价方法一、短期试验1.致突变试验程序筛检阳性筛检阴性具有遗传毒性的致癌物具有遗传毒性的非致癌物非遗传毒性的非致癌物非遗传毒性的致癌物第四节化学致癌作用的评价方法一、短期试验筛检阳性具有遗传第四节化学致癌作用的评价方法短期试验恶性转化试验对培养细胞诱发与肿瘤形成有关的表型改变，包括细胞形态、细胞生长能力、生化表型等变化，以及移植于动物体内能形成肿瘤的能力使用的细胞原代细胞：叙利亚仓鼠胚体细胞（SHE细胞）

人类成纤维细胞

小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等细胞系：BALE/C-3T3、C3H10T1/2、BHK-21等细胞系病毒感染细胞：RLV/RE细胞——劳舍尔白血病病毒感染

的Fisher大鼠胚体细胞SA7/SHE细胞——猿猴腺病毒感染的SHE细胞第四节化学致癌作用的评价方法短期试验原代细胞：叙利亚仓鼠第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验优点试验周期短需要观察的靶器官指标少节省人力和物力反映受试物与动物直接接触的情况能验证受试物的致癌性、助癌性和促癌作用等机制试验类型小鼠皮肤肿瘤诱发试验小鼠肺肿瘤诱发试验大鼠肝转化灶诱发试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验小鼠皮肤肿瘤诱发试验试验动物：SENCAR小鼠试验方法：局部连续涂抹受试物试验周期：一般为9个月，如果在启动后使用佛波酯则缩短至20周评价指标：皮肤乳头瘤和其他肿瘤的发生率特点：可检测受试物的启动活性或促癌活性，典型启动剂为多环芳烃，促长剂为佛波醇酯第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验小鼠肺肿瘤诱发试验试验动物：SWR小鼠或A系小鼠试验方法：一次或多次给予受试物后，或一次给予受试物1~2周后持续多次给予促癌剂染毒途径：腹腔注射、灌胃或吸入试验周期：16~30周评价指标：肺肿瘤发生率特点：可检测受试物的启动活性或促癌活性，典型启动剂为乌拉坦（抗肿瘤药物），促长剂为二丁基羟基甲苯（BHT）第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验大鼠肝脏转变灶诱发试验试验动物：敏感大鼠试验方法：按染毒程序给予受试物试验周期：8~16周评价指标：肝转化灶和肿瘤结节生成转化灶特点：癌前病变，变化用免疫组化或酶组织化学方法鉴定特点：可检测受试物的启动活性或促癌活性，典型启动剂为二乙基亚硝胺（DEN），促长剂为苯巴比妥（PB）第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验第四节化学致癌作用的评价方法哺乳动物短期致癌试验雌性大鼠乳腺癌诱发试验试