祛瘀解毒消汤对em模型大鼠腹腔液il-6、il-8的影响

祛瘀解毒消汤对em模型大鼠腹腔液il-6、il-8的影响

子宫内膜综合征（pmt）不仅是一种常见的妇科疾病，也是一种难治性疾病。因此，近年来已成为妇科领域的研究热点。国内外学者研究发现,腹腔微环境中巨噬细胞分泌多种细胞因子,而EMT患者腹腔液中许多细胞因子的水平高于正常妇女,提示细胞因子参与改变腹腔环境的免疫动态平衡,在EMT的发生发展中起着重要作用。本研究旨在观察祛瘀解毒消癥汤对EMT模型大鼠腹腔液中细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)水平的影响,为临床以祛瘀通络、解毒化浊、消癥止痛为法组成的中药复方制剂治疗本病的有效性提供实验依据。选取SPF级9周龄的健康性成熟未交配SD大鼠60只,体重180±20ɡ/只,动物合格证:SCXK(陕)2007-001号,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。饲养环境:室温25±5℃,湿度55±5%,空气清新,通风良好,自由进食标准大鼠饲料、自来水。祛瘀解毒消癥汤:由陕西中医学院制剂室,将中药煎煮浓缩成含生药2.0g/mL的汤剂。丹莪妇康煎膏:由昆明滇虹药业有限公司生产提供,批号:091208,以1%的甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解成含生药0.2g/mL的溶液。IL-6、IL-8酶免试剂盒:购自西安永屹生物技术有限公司。10%水合氯醛250g/瓶:西安杨森制药厂生产,批号:0911635。0.9%氯化钠500mL/瓶:西安康华制药厂生产,批号:0912089。75%酒精500mL/瓶:西安康华制药厂生产,批号:1001920。注射用青霉素钠80万单位/支:哈药集团制药总厂,批号:A090801910。苯甲酸雌二醇注射液:2mg/mL,由上海通用药业股份有限公司提供,批号:100103。根据施氏法以每千克体重折算系数计算出给药剂量,配备好的试验组及对照组药物均置冰箱4℃备用。电子分析天平、全自动酶标仪由上海恒平科学仪器有限公司生产;电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9075)由上海一恒科技有限公司生产;高速旋转离心机由北京东讯天地仪器有限公司生产;快速混匀器(sk-1型)由常州国华电器有限公司生产;手提式压力蒸汽消毒器(YX-280B型)由江阴滨江医疗设备厂生产;NR-B17CC型冰箱由日本松下公司生产。EMT模型制备:采用经典的造模法。建模成功的标志为异位病灶呈米粒大小之结节,切面可见线形闭合水孔,异位内膜组织均形成囊状,囊内为无色透明液体,有的囊形成多个串珠状,周围可见丰富血管形。在造模成功的大鼠中随机选出40只,随机分为5组,加空白组共6组,具体分组情况如下:A组为空白组,B组为模型组,C组为丹莪妇康煎膏组,D组为祛瘀解毒消癥汤低剂量组,E组为祛瘀解毒消癥汤中剂量组,F组为祛瘀解毒消癥汤高剂量组。每日清晨对大鼠称重后,采取同一时间灌胃给药,具体给药方法如下。A组:生理盐水灌胃,10mL/kg·d,连续28d;B组:生理盐水灌胃,10mL/kg·d,连续28d;C组:丹莪妇康煎膏溶液,2g/kg·d,连续28d;D组:祛瘀解毒消癥汤10g/kg·d,连续28d;E组:祛瘀解毒消癥汤20g/kg·d,连续28d;F组:祛瘀解毒消癥汤40g/kg·d,连续28d。肉眼观察模型组及药物干预后各组大鼠异位内膜液体积聚、血管形成及与盆腔腹膜、大网膜粘连等情况。末次给药后,禁食不禁水12h,10%水合氯醛腹腔麻醉后,注入生理盐水5mL/只,取腹腔液2mL,2000rpm,10min离心,取上清液-20℃冻存。用酶联免疫测定法(ELISA法)检测腹腔液IL-6、IL-8含量,严格按照试剂盒说明书所示方法进行实验操作。应用SPSS13.0统计软件,对数据进行分析处理。各组数据均用“均数±标准差(ue0af±s)”表示,采用t检验,P﹥0.05表示无统计学意义,P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有非常显著性差异。种植在腹壁上的子宫内膜呈透明的囊泡形状,可见液体积聚,与盆腔腹膜、大网膜广泛粘连,异位内膜表面有血管形成。祛瘀解毒消癥汤低剂量组:囊泡样的异位内膜较模型组有所缩小,与周围组织粘连明显,囊内可见液体积聚。祛瘀解毒消癥汤中剂量组:异位内膜囊泡缩小的程度较低剂量组明显,与周围组织粘连较低剂量组减轻,但囊内仍有少量的无色透明液体。祛瘀解毒消癥汤高剂量组:异位内膜囊泡较模型组明显缩小,甚至消失,仅呈痕迹,个别异位内膜与周围组织有少量粘连,囊内未见液体。丹莪妇康煎膏组:异位内膜缩小的程度与祛瘀解毒消癥汤中剂量组大体相似,但与周围组织粘连较为明显。2.2氧合物对氧漂消汤高剂量对丹不同妇康侧膏的影响由上表可见,空白组大鼠腹腔液中IL-6含量的低表达,与模型组比较有非常显著性差异(P<0.01);祛瘀解毒消癥汤高剂量组与模型组比较有非常显著性差异(P<0.01);祛瘀解毒消癥汤低、中剂量组及丹莪妇康煎膏组,与模型组比较均有显著性差异(P<0.05);祛瘀解毒消癥汤各剂量组与丹莪妇康煎膏组比较均无显著性差异(P﹥0.05)。2.3emt的细胞因子及免疫反应由上表可见,空白组腹腔液中IL-8水平的低表达,与模型组比较有非常显著性差异(P<0.01);祛瘀解毒消癥汤各剂量组及丹莪妇康煎膏组IL-8均低表达,与模型组比较均有非常显著性差异(P<0.01);祛瘀解毒消癥汤各剂量组与丹莪妇康煎膏组比较均无显著性差异(P>0.05)。本实验利用大鼠建立EMT模型,予中药祛瘀解毒消癥汤干预后,用肉眼大致观察到各试验组大鼠异位内膜体积较模型组明显缩小,与周围组织粘连的程度有所减轻。初步显示祛瘀解毒消癥汤有抑制异位内膜生长和炎症反应、阻止新生血管的作用。自从1860年VonRokitansky等首先描述EMT至今,其确切的病因及发病机制尚不完全明了,但普遍认为是遗传、免疫、内分泌等多种因素综合作用的结果。而免疫因素在EMT的发生、发展中的作用机理,则是目前最为引人注目的研究热点。国内外研究已经证实,细胞因子参与改变腹腔环境的免疫动态平衡,在本病的发生发展中起着重要作用。细胞因子种类繁多,而许多研究表明,由单核和巨噬细胞产生的IL-1、IL-2、IL-6、IL-8均属于促炎细胞因子,参与细胞免疫反应。近年研究发现,IL-6、IL-8与EMT关系尤为密切。IL-6是一种糖蛋白,其作为一种最常见的前炎症介质,具有非常广泛的生物学效应。腹腔液中IL-6含量的增多,使得腹腔液中巨噬细胞和炎症细胞被介导吸引活化,从而发生炎症及免疫反应,导致盆腔粘连及免疫异常,加速了EMT的形成和发展。此外,高水平的IL-6还能促进B淋巴细胞终末分化为浆细胞,血中IgG、IgM增高,相应在体内产生多种自身抗体,发生抗原抗体反应,各种免疫复合物随即产生,造成患者机体免疫的损害。本研究显示,EMT模型大鼠腹腔液中细胞因子IL-6水平明显高于空白组,证明细胞因子IL-6确实参与了子宫内膜异位病灶的种植和生长,并且可能与疾病的严重程度相关。而祛瘀解毒消癥汤干预后使IL-6水平降低,说明该方能调节和改善EM异常免疫状态、抑制渗出、粘附、增生等炎症反应,从而抑制了模型大鼠异位内膜的病理发展。IL-8是一种低分子蛋白质,来源于活化的T淋巴细胞、单核-巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞等多种细胞,具有趋化中性、嗜酸性、嗜碱性粒细胞及T淋巴细胞的作用。已有研究表明,IL-8在EMT病人的腹腔液和外周血中浓度明显高于正常妇女;IL-8通过趋化炎性细胞聚集以及促使新生血管的形成,对盆腔内炎症、粘连产生及异位病灶中新生血管的生成等均有重要作用。本研究显示,EMT模型大鼠腹腔中IL-8含量明显高于空白组,再次证明细胞因子IL-8促进了子宫内膜异位病灶的种植和生长,而用祛瘀解毒消癥汤干预后IL-8水平明显降低,说明该方通过免疫调节,抑制了炎性细胞的聚集和新生血管的形成,从而阻止了模型大鼠异位内膜的形成、发展。结合现代医学对EMT发病的基本认识,中医认为本病源于“离经之血”,属于血瘀证范畴,故而运用活血化瘀法也就成为治疗本病之根本大法,而观察用活血化瘀类中药对于EMT患者免疫功能的影响亦屡有报道。针对本病虽属良性却具有增生、浸润、转移及高复发等恶性行为的特征,新近有不少学者提出EMT的发病机理为瘀血、恶血壅阻于胞宫、胞脉,日久蕴而化毒,转化为瘀毒,主张用祛瘀解毒法治疗本病。我们在借鉴这些新的观点的基础上,结合当代中医新的络病学说和浊、毒理论,认为本病属络病,病位在胞宫、冲任之络脉,瘀、湿、浊、毒互结损络是其病理特征,“伏毒依时而发”是其发病特点。据此拟定祛瘀通络、解毒化浊、消癥止痛治法,并拟定祛瘀解毒消癥汤。前期研究显示,该方用于临床不仅对EMT之痛经、癥瘕有较好疗效,还能降低其升高的血清CA125,转阴血清抗子宫内膜抗体。本研究显示祛瘀解毒消癥汤对模型大鼠腹腔液中异常升高的IL-6、IL-8水平具有改善作用,说明该方确能调节和改善EMT患者自身免疫功能的异常,此亦应是其临床有效性的作用机理之一。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物1.1.2主要实验药物和试剂1.1.3制备1.1.4主要设备和设备1.2实验方法1.2.1模型准