植物单宁的研究进展

植物单宁的研究进展

植物单体是植物以碳为基础的复杂酚类二级代谢产物，通常出现在植物茎、叶、树皮、花和种子的薄壁和液体泡沫中。单宁在维管束植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素,是植物进化过程中由碳水化合物代谢衍生出来的一种自身保护性功能类物质,也是植物与环境相互作用的产物。单宁主要分布在热带和亚热带及干旱、半干旱地区的豆科(Leguminosae)牧草中,一些以采食枝叶为主的嫩枝叶类植物种(browsespecies)和油菜(·Brassicarapa)籽、高粱(Sorghumbicolor)等农作物中。在一个特定的空间规模中,牧草单宁种类和含量是多样化的,主要取决于植物物种,植物生长发育的阶段、季节、环境条件和土壤可利用营养。早期研究表明,相对于肥沃土壤而言,生长在贫瘠土壤中的植物单宁含量较高。如McKey等1978年研究发现,在贫瘠土壤中,树叶中单宁丰富度相对较高。这些规律的理论和概念框架已经普遍被生态学家接受和理解。但单宁由于结构构造的复杂性,有效的单宁测定方法是困扰学者对植物单宁研究的一个问题;与不同的提取溶剂反应,单宁可以产生不同的颜色,普鲁士蓝法(Prussianblue)、福林酚法(FolinCiocalteu)以及盐酸/丁醇法(HCl/Butanol)都已经广泛应用于单宁含量的测定。其中,福林酚反应法利用与酚基团反应产生蓝色,但此方法并不单单与单宁反应,同时与小分子酚类化合物也反应。盐酸/丁醇法主要用来测定3部分:可提取缩合单宁、蛋白结合单宁以及纤维单宁。单宁由于化学结构和生物活性的多样性,特别是其含有的大量羟基,在调控反刍动物营养代谢中起重要作用。植物单宁对反刍动物营养代谢的作用主要依赖植物饲料中单宁浓度含量的高低,适量的单宁浓度(5～55g·kg-1)在动物体内时,单宁可以降低蛋白质的瘤胃降解率而提高氮的利用率,增加小肠氨基酸流量从而提高牧草蛋白质利用效率,同时可以抑制反刍动物膨胀病和寄生虫病的发生。除此之外,低到中等浓度(20～40g·kg-1)的单宁可以提高动物平均排卵率、体重、产毛率和产奶量,减少反刍动物甲烷排放。但当单宁浓度高于60g·kg-1时,单宁被认为是饲料的抗营养因子,会通过降低牧草饲料适口性和养分消化率而影响反刍动物营养代谢微环境,最终影响动物的生产性能。单宁在限制反刍动物营养吸收和微生物酶活性方面的研究大量集中在豆科牧草中,包括胡枝子属(Lespecdeza)、红豆草属(Onobrychis)、岩黄芪属(Hedysarum)、小冠花属(Coronilla)、百脉根属(Lotus)和三叶草属(TVrifolium)。1缩合固单化合物的提取从化学结构和物理性质看,单宁被划分为缩合单宁(condensedtannin,CT)和水解单宁(hydrolysabletannins,HT)2大类。水解单宁是以碳水化合物为中心,周围羟基与酚酸(以大蒜酸和鞣花鞣质)发生酯化的一类化合物,并且在弱酸和热环境中容易被水解。相比之下,缩合单宁,又被称为原花色素,是以无分支黄酮类化合物为主的聚合物,不易被水解,但在热矿物质酸中易被氧化。植物中所含的不同类型单宁有不同的理化性质,包含酚类物质的通性和其固有特性。主要表现出很强的极性,与蛋白质结合形成不溶于水的复合物沉淀的特性,这种结合的化合物并不稳定,结合的位点不停的发生解离与再结合。Terrill等1992年通过缩合单宁提取方法的更新和改进,认为缩合单宁包括3部分,分别为可提取缩合单宁(extractablecondensedtannin)、蛋白结合单宁(protein-boundcondensedtannin)以及纤维结合单宁(fiber-boundcondensedtannin)。大量的研究表明,植物单宁广泛分布在温带和热带及干旱、半干旱地区的豆科植物(Leguminosae)、禾本科植物(Poaceae)和杂类草中(表1)[9,11,12,13,14,15,16,17]。后有研究发现,在蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salix)、杜鹃花科(Ericaceae)、山毛榉科(Fagaceae)和柏科(Cupresaceae)植物中均有不同浓度的单宁存在。表1所示详细汇总了常见饲料植物中不同类型的缩合单宁含量,不同物种和植物部位的单宁浓度有很大的差异,可提取缩合单宁变化范围为0～196g·kg-1DW,通过对25种植物单宁平均含量确定,可提取缩合单宁占总缩合单宁的54.3%,略低于普遍认为的热带豆科植物的70%～95%和温带的68%。在豆科植物中,包括红豆草属、岩黄芪属、小冠花属、百脉根属和三叶草属都含有较高浓度的缩合单宁,不同类型植物中的缩合单宁以及结合部分的缩合单宁含量并不相同。但总体而言,豆科植物中的缩合单宁含量高于其他类型植物。在温带豆科植物中,蛋白质结合单宁变化范围小于可提取缩合单宁,纤维结合单宁含量更少,甚至可以忽略。热带以嫩枝叶类为主的豆科牧草,像卵叶山蚂蝗(Desmodiumovalifolium)、大叶千斤拔(Flemingiamacrophylla)和银合欢(Leucaenaleucocephala)3类缩合单宁相当,每类单宁的含量都高于温带牧草。2评价点的整合分析大量的研究已经证明影响植物单宁含量的因子比较多,基本涉及到生物发育和生长的生物和非生物因子都参与植物单宁含量的积累。生物因子主要包括不同的植物物种、生长发育期、植物的构件(叶、花、茎、果实和根系),以及生物量分配和环境中昆虫、细菌、真菌、草食动物。非生物因子包括温度、土壤含量水、土壤肥力和单宁的测定方法。一般而言,高温、高水压、高光密度和贫瘠土壤条件都会增加植物体内单宁含量。通过对全球72个研究地点,805个植物叶片单宁浓度与年均温度、降水和纬度的整合分析(Meta-Analysis)显示,全球植物单宁丰富度与年平均温度显著正相关,年降水和纬度不能影响单宁的丰富度。但该研究的缺点是,所整合分析的26个研究中对单宁提取所使用的方法和标准曲线是不一致的,影响到不同物种的单宁含量,也影响对全球植物单宁分布规律的总结。目前大部分研究都是针对单一因子对单宁含量的影响,很少涉及到不同因子间的交互作用对单宁浓度的影响,在生态系统中,复合因子的作用可能更合理,或更有意义。Anurage等1993年研究土壤含水量和温度对百脉根(L.pedunculatus)单宁含量的影响证明,单宁浓度对温度单独影响没有变化,然而当土壤含水量降低并伴随着温度升高引起百脉根生长速率的降低,从而引起单宁含量的升高,是2种非生物因子共同作用的结果。然而即使季节性和气候变化所引起的环境变化都强烈的影响单宁含量及其在不同器官的比例,但没有一种普遍的环境因子或某一种资源物质控制着单宁浓度,不同物种的变化强度和方向具有物种专一性(species-specific),可能各物种体内的遗传基因或生物合成途径控制着单宁的合成。单宁在植物构件(器官)中的特异化已经在很多牧草中被定位。白三叶(T.repens)中,单宁仅出现在花中;苜蓿(Medicagosativa)仅出现在种皮。单宁构件的特异化为研究者在证实单宁生物合成路径中基因结构和调控提供了理论支持,也为牧草育种家提供了操控单宁聚集浓度的基因理论。3植物仅对反刍动物健康繁殖的影响3.1减少膨胀病的牧草品种膨胀病是由于反刍动物采食牧草而引起的一种常见且严重致命的消化紊乱疾病。已经严重影响北美、加拿大、澳大利亚、新西兰和南美等国的动物生产。当动物采食牧草,尤其是春季豆科牧草时,牧草被反刍动物咀嚼并在动物体微环境中发酵,由于可溶性蛋白质的溶解度较高,快速发酵所产生的气体被限制在动物瘤胃中并形成连续稳定的泡沫,这种泡沫阻止动物正常的气体排放,使胃容积和压强增大,最终导致动物胀肚死亡。到目前为止,关于发生膨胀病的机理仍然不是很清楚,并没有很确定的方法去控制,但有研究指出含有单宁的牧草可以抑制该病发生,如Kendall在1966年是第一个提出牧草中的单宁可能阻止反刍动物膨胀病的发生,他推测可能是这些牧草中的单宁结合了可产生泡沫的可溶性蛋白或抵制泡沫的产生。Cooper等调查了27种豆科牧草发现,含单宁的牧草比无单宁的牧草产生更少体积的瘤胃泡沫。现在普遍认为含有适量单宁的牧草可以抑制膨胀病的发生,由于单宁可与蛋白质的多个位点结合,使蛋白质的空间构象发生改变,减缓或阻止蛋白质在消化道内的降解速率,从而防止瘤胃臌气。研究证明大量的含有单宁的豆科牧草,像红豆草(O.viciifolia)、百脉根、小冠花(C.varia)和紫色达利菊(Daleapurpurea)等,被认为家畜采食安全物种,而苜蓿被证明是最易发生膨胀病的牧草。对于膨胀病的防治,主要包括以下3个方面:①放牧场的管理。如豆科牧草开花期禁牧;午后家畜移出放牧场;连续放牧不能间断;药剂辅助供应;②牧草育种。1979年加拿大农业部萨斯卡通研究站是最早启动研究筛选抑制膨胀病的苜蓿品种,分前育种(pre-breeding)、筛选(selection)和评估(evaluation)3个阶段对苜蓿进行筛选,并在1997年成功获得一个可能减少膨胀病发生的品种,命名为ACGrazelandBr。随着分子生物技术的发展,引入单宁基因到苜蓿品种已引起较多的重视,但苜蓿仅在种皮有微量的单宁,一个可选择的方向就是利用转基因技术,把含有较高单宁浓度物种的基因片段合成到苜蓿品种中,最终实现培育具有单宁的牧草品种。③建立混合牧草草场。引入含有单宁牧草到放牧场是简单有效的抑制家畜紊乱的方法。但到目前为止,放牧场中单宁牧草与其他牧草混合的比例没有一致的结论。在对35%红豆草+65%苜蓿混合草场与纯种苜蓿草场的对比试验中得到,混合草场在第一茬开花早期放牧,可以降低80%膨胀病发病率,当在第2茬再生草放牧时,可降低77%的发病率。而Li等通过评估反刍动物日粮中添加苜蓿和三叶草后发生膨胀病的概率时,认为日粮中安全单宁浓度应为5g·kg-1。假设在只有苜蓿和红豆草混合草场放牧,其中红豆草单宁含量为4%(干物质),在肉牛每天采食10kg干草的情况下,红豆草所占比例至少达到12.5%的时候,才能有效抑制膨胀病的发生。3.2缩合配方的筛选反刍动物采食牧草易受到寄生虫感染的威胁。绵羊皱胃和小肠内的寄生虫引起体内大量蛋白质的损失,而机体所受的损伤必须依靠更多的蛋白质合成来修复,这将导致其体内氮沉积降低,故更容易受到寄生虫的感染,形成恶性循环。而动物寄生虫的防治工作迫在眉睫,寻找抗寄生虫的驱虫剂具有非常重要的意义。同时考虑到使用化学药剂对动物本身和畜产品有副作用,科学家们努力选择一种非化学药剂的抗虫剂,研究发现饲草中的缩合单宁是一种非化学性的驱虫剂。驱虫剂处理后的羔羊(无寄生虫)采食含缩合单宁的冠状岩黄芪(H.coronarium)和不含缩合单宁的紫花苜蓿后,其生长速度相当;而没有驱虫的羔羊在采食冠状岩黄芪时生长更快,显示其能更好的抵抗寄生虫作用。采食冠状岩黄芪的羔羊在屠宰时粪中的虫卵数和寄生虫的重量分别为采食紫花苜蓿羔羊的42%和45%。Hoskin等的研究发现在豆科牧草中缩合单宁的含量与鹿皱胃中的线虫(Nematodes)数量成显著负相关,缩合单宁组粪便中肺线虫幼虫的数量显著低于对照组(无缩合单宁)。Poppi等则认为,豆科植物中缩合单宁提高过瘤胃蛋白后能够抵消由GI线虫感染所引起的蛋白损失。Molan等体外试验表明,豆科牧草中缩合单宁的提取物具有抑制鹿源肺线虫虫卵转化为可侵染的幼虫以及减弱鹿和绵羊大肠线虫幼虫的活性。单宁之所以能够抑制寄生虫,可能包括2种调控机制,第1个是含有单宁的牧草提高了必需氨基酸的利用,从而阻碍肠道寄生虫引起的蛋白质损失或增加动物的免疫力。第2个解释是单宁可以直接和肠道内寄生虫幼虫反应,使寄生虫失去活性。因此含有单宁的牧草在提供了有利于动物健康生长的营养的基础上,控制了寄生虫的生长,进而可以减少化学驱虫剂的使用。4植物仅对反刍动物营养的影响4.1整理后的热重变化单宁可以和蛋白结合的能力是其主要的化学特性。单宁能与植物中的蛋白质结合,降低该蛋白质在瘤胃中的溶解度和表面活性,避免被瘤胃微生物迅速降解,增加过瘤胃蛋白数量,从而提高蛋白质利用效率。这种被单宁结合而未被瘤胃消化的蛋白被称为过瘤胃蛋白或瘤胃逃逸蛋白(ruminalescapeprotein)。因此,有人认为单宁可改变草食动物蛋白质消化过程并能够对草食动物产生积极影响,实际上并非全部单宁都能够减少饲料蛋白在瘤胃的消化率,同时提高小肠可消化蛋白的比例。部分缩合单宁能够增加过瘤胃蛋白的比例,通常草食动物采食富含单宁的植物后会减少尿中的氮含量,而粪中的氮含量略微增加。因此,相比较采食相同营养物质的非单宁饲料,单宁饲料能够增加动物对氨基酸的吸收。目前,单宁减少瘤胃消化蛋白并提高蛋白利用率的精确机制还不完全清楚。Jones和Mangan通过体外试验证明单宁和蛋白质通常是在瘤胃pH6～7的情况下发生结合,并在皱胃pH<3.5时发生解离,从而释放出更多的蛋白质供胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。单宁和蛋白质这种结合后过瘤胃,在皱胃中再分离的作用,被认为是一种能够增加小肠氨基酸吸收率的途径。目前还不完全清楚单宁和蛋白在后肠消化道解离后,是否与动物内源性蛋白如消化酶等相结合。如红斧折木(Schinopsislorentzii)中单宁并不能够产生过瘤胃蛋白,但却能够降低小肠蛋白质吸收率,这很可能是由于单宁未与饲料蛋白相结合,而与小肠内源蛋白结合的缘故。但是,单宁对瘤胃微生物,以及对后肠消化道微生物的影响很可能是影响蛋白质消化的另一个因素。Nelson等的研究发现,从百脉根中提取的单宁能够降低瘤胃总微生物的数量并降低瘤胃微生物进入皱胃的量。除此之外,Min等研究发现,百脉根中的单宁直接影响瘤胃消化利用蛋白的细菌,降低蛋白降解菌的数量。因此,当单宁严重抑制蛋白质消化时,作用较强的一类单宁对于草食动物蛋白的消化也会产生消极影响。当绵羊饲喂长柄百脉根(L.pedunculatus)(99g·d-1)和百脉根(116g·d-1)2种高缩合单宁含量的植物时,百脉根能够增加绵羊约62%的小肠可利用必需氨基酸,而长柄百脉根对小肠氨基酸的利用率并无影响。尽管两者都能增加十二指肠非氨态氮的流速,但只有百脉根能够提高小肠必需氨基酸的吸收率。影响2种植物对小肠必需氨基酸吸收的原因可能是百脉根缩合单宁并未影响必需氨基酸(占小肠非氨态氮的比例)在小肠中的表观消化率(apparentdigestibility),虽然长柄百脉根也能够增加十二指肠非氨态氮的氮流速,但必需氨基酸在小肠中的吸收率却受到影响。Bermingham等的试验也证实,尽管饲喂红三叶草(Sainfoin)和冠状岩黄芪(Sulla)都能提高十二指肠非氨态氮的氮流速,但红三叶草(38g·kg-1DM)对小肠必需氨基酸的吸收并无影响,而绵羊饲喂冠状岩黄芪时(64g·kg-1DM),小肠必需氨基酸的吸收率显著上升,这可能与两者所含单宁的化学结构不同所致。目前还不完全清楚缩合单宁对氨基酸小肠吸收过程的影响,但很可能氨基酸在小肠消化吸收过程中,长柄百脉根中的单宁和红三叶草中的蛋白结合物,特别是包含必需氨基酸的部分未发生解离,最终导致小肠对必需氨基酸较低的吸收。4.2聚合反充物pa、配方前配方的影响植物单宁在反刍动物营养中的作用已经被广泛应用,它不仅可以有效的防止反刍动物瘤胃胀气、增加过瘤胃蛋白和氨基酸的含量,也能有效的提高动物生产性能与健康水平。大量研究已经证明百脉根中的单宁浓度与动物营养功能有积极或消极关系(表2),总结后可发现当百脉根干物质中单宁浓度在18～50g·kg-1时,对反刍动物毛生长率和产毛量,排卵率和产奶量等都有积极作用;当干物质内单宁浓度高于60g·kg-1时,动物的各方面生产性能都有所降低;而浓度在50～60g·kg-1时,动物营养功能不稳定[33,41,47,48,50,51,52,53,54,55,56]。适当的单宁浓度对动物生产性能和健康发展有积极意义。单宁和反刍动物间的作用机制和影响都是复杂多变的,尽管会影响动物的生产性能和健康,但这种影响机制仍没有一致的结论,可能单宁和营养物质间有相互作用,或单宁和微生物间有相互作用,也有可能是单宁和动物机体本身的作用。而单宁对反刍动物生产性能与健康方面的积极作用主要体现在以下几个方面。4.2.1缩合固单对产毛量的影响羊毛主要是由蛋白构成,且蛋白质中胱氨酸占的比例很大,同时,产毛过程中对含硫氨基酸的需求量很大。有研究表明当羊饲喂粗饲料中加入蛋氨酸和胱氨酸,能有效刺激羊毛生长和氮滞留,添加1～3g蛋氨酸,可提高毛生长率的10%～40%。Min等证明羊饲喂百脉根能增加15%羊毛重,归因于百脉根中所含的单宁能促进含硫氨基酸等动物必需氨基酸的吸收。而百脉根也能增加血液中胱氨酸的比例,这是由于2种植物中的缩合单宁降低了含硫氨基酸在瘤胃中的降解所致。因此单宁对产毛量的影响主要是通过提高氨基酸吸收而影响,同时也与单宁浓度和类型密切相关。当饲喂百脉根时(22～38g·kg-1),产毛量会有大约10%的提升,但当缩合单宁超过50g·kg-1时,产毛量迅速下降,特别是当饲喂长柄百脉根和冠状岩黄芪时,过高的缩合单宁含量对产毛量影响较大。而缩合单宁含量低于22g·kg-1时,对产毛量的影响变化较大,因此百脉根为22～38g·kg-1时被认为是对产毛量最有利的缩合单宁添加量。对于高浓度单宁降低产毛率的一种解释是单宁能提高动物的荷尔蒙浓度而使反刍动物氮沉淀并滞留在瘤胃中,导致氨基酸不能参与羊毛生长和产量合成。4.2.2支链氨基酸在平台细胞发育情况营养状况是影响绵羊排卵率(ovulationrate)的一个重要指标,但对于营养状况对排卵率的影响机制尚不清楚,一种解释认为营养状况与卵巢分泌激素的水平密切相关。血液中生长激素、胰岛素以及胰岛素生长因子(insulinlikegrowthfactor)的浓度伴随着机体能量,蛋白平衡和肌蛋白合成直接影响卵巢功能,或通过调节促性腺激素来调节卵巢的功能。也有报告指出,血液中支链氨基酸以及必需氨基酸的水平与排卵率(OR)正相关,静脉注射支链氨基酸能够增加排卵率。Faure等的试验也证实,细胞液中支链氨基酸转移酶含量主要随着绵羊骨骼肌肉中支链氨基酸的活性下降而增加,这也就意味着,支链氨基酸可能直接刺激影响卵巢或通过其他未知机理增加排卵率。通过连续6周在多年生黑麦草(Loliumperenne)+白三叶(1g·kg-1CT)和百脉根(23g·kg-1CT)牧场放牧发现,百脉根所含缩合单宁能够将母羊排卵率提高22%。原因可能是缩合单宁在不影响排卵母羊与交配母羊比例的情况下,通过增加繁殖力(黄体与母羊排卵率比例)来提高产羔率(1.7和1.4)。也可能是日粮中高摄入可溶性蛋白通过影响子宫内部环境而影响生殖,如氮代谢的有毒副产品(氨和铵离子)能损伤精子、卵细胞和早期胚胎生存率,而含有单宁的百脉根能减少蛋白质被微生物降解变成氨气,进而降低血液中氨态氮含量,提高卵细胞的存活比例。单宁影响反刍动物生产和繁殖性能的机制仍存在不确定性,仍然需要进一步的研究。4.2.3饲泌乳牛奶的营养成分Wang等的试验数据表明,绵羊在含有缩合单宁的百脉根草地放牧对绵羊泌乳早期无影响,但在泌乳中后期可提高绵羊奶产量(21%)、乳糖(12%)和乳蛋白(14%)的含量。Min等的综述表明,在不影响采食量的情况下,饲喂泌乳奶牛百脉根相比较饲喂无单宁的黑麦草,牛奶产量提高60%,乳蛋白提高10%。氨基酸,尤其是必需氨基酸限制着乳蛋白合成,蛋氨