苹果中正己醇降解酶的提取与分离纯化研究

苹果中正己醇降解酶的提取与分离纯化研究

正自醇是食品加工的一部分，尤其是酒精饮料生产中产生的杂醇醇高级醇，具有强烈的刺激性，对食品的味道有不利影响。过多地摄入会使人的神经系统充血,引起头痛,具有一定的生理毒性,即人们常说的白酒上头的原因。另外,正己醇也是引起大豆豆腥味的主要成分之一。近年来,随着人们对正己醇危害性认识程度的加深,以及检测技术的发展和检测灵敏度的提高,人们对正己醇的生理毒害的重视程度也越来越高。适当降低产品中正己醇含量对提高食品质量和安全性有重要意义。目前,正己醇的转化主要是化学方法,如将正己醇转化为正己醛或己酸己酯。但是,化学催化会引入新的不安全因素,不适用于食品加工。酶法转化则因其具有催化效率高、安全、对环境友好等优点在食品加工方面有很好的推广应用前景。已有研究显示,正己醇大量地存在于各种植物组织中,呈现青草气息的水果味,是苹果鲜果和苹果汁中香气成分的重要组分之一。植物体内正己醇主要由氨基酸的分解代谢或脂肪酸的合成代谢而产生。苹果中的正己醇主要来自于果实发育过程中的脂肪氧化酶和醇脱氢酶对脂肪酸的β氧化作用。Kim和Grosch研究发现,苹果中的脂肪氧化酶(LOX)能形成氢过氧化物,对苹果中正己醇和正己醛的生成有重要作用;正己醛则在苹果醇脱氢酶(ADH)的作用下生成正己醇,因而成熟的苹果中同时存在正己醛和正己醇。由此推测,如果上述反应为可逆反应,则在苹果体内必然存在将正己醇转化为正己醛或其它物质的酶系。为此,利用苹果体内的酶系降低正己醇含量的生物转化是有可能的。我们的前期研究也证明了苹果中的确存在能够降低正己醇的酶系,并对其作用的最适pH和最适温度有了初步了解。本文拟在前期研究的基础上,旨在为苹果中的正己醇降解酶寻求较好的制备方法,并进行初步纯化的探索,为其进一步应用提供基础。1材料和方法1.1限公司进口装配苹果:市售成熟的红富士苹果,无伤痕、无病害、品质良好,购于陕西杨凌水果市场。主要试剂:正己醇,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司进口分装;丙酮、柠檬酸、柠檬酸钠、三氯乙酸(TCA)、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(AP)均为国产分析纯;考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、牛血清白蛋白,为优级纯。1.2仪器及其制备HZS-H水浴振荡器,哈尔滨市东明医疗仪器厂;GC9800(FP)气相色谱仪,上海科创色谱仪器有限公司;丹佛T-203型电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;ST-303织匀浆器,广东美斯特电器;F-101电动搅拌器,巩义市英峪予华仪器厂;GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机,海安亭科学仪器厂;UB721紫外分光光度计,日本岛津;DYCZ-22A型电泳槽,北京六一仪器厂。1.3苹果果皮提取物制备将多个同一品种苹果(4℃预冷2d)果皮部分(厚度0.4～0.5mm)混匀之后,及时称取200g,按照以下几种方法分别处理,所得粗酶液均定容至100mL,冷藏备用。缓冲体系:0.1mol/L的4℃预冷的pH值4.6的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液。(1)缓冲溶液提取法:称取上述苹果果皮200g,溶解于100mL上述缓冲体系,用组织匀浆器打碎,匀浆液超声波破碎20min(冰浴),破碎功率固定为20kHz、20W,再用4层干净纱布过滤,取滤液在4℃下4000r/min离心30min,取上清液冷藏于4℃冰箱,备用。(2)丙酮粉提取法:在200g上述苹果果皮中加入50mL冷冻丙酮(-30℃),在高速组织匀浆机中打浆,将果浆转入烧杯中,加入100mL冷冻丙酮,用玻璃棒缓慢搅拌1min,用真空泵抽滤,滤渣再用100mL冷冻丙酮溶解,经玻璃棒搅拌均匀后,再次抽滤。如此反复,直至滤渣为无色为止,滤渣转入真空干燥器至干,即得粗酶粉。将上述粗酶粉溶解于100mL上述缓冲体系中,在4℃下用电子恒速搅拌器缓慢搅拌30min,再用4层干净纱布过滤,取滤液在4℃下4000r/min离心30min,取上清液冷藏于-40℃冰箱,备用。(3)TritonX-100提取法:同(1)但缓冲体系中含1%的TritonX-100。(4)TritonX-100+PVPP提取法:同(1)但缓冲体系中含1%的PVPP和TritonX-100。1.4正在进行的醇分解能力的测定1.4.1反应系统正己醇浓度为1.3g/L的10mL柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH4.6,浓度0.1mol/L),酶液用量2mL。1.4.2正己醇残留量的测定测定粗酶液的正己醇降解能力时,直接在1.4.1反应体系中加入2mL粗酶液进行反应,对照均为:用2mL上述缓冲体系代替酶液的反应体系。反应条件:37℃、100r/min水浴,反应4h。反应结束后,及时取样,立即冰浴后置于4℃下贮存,用于测定正己醇残留量。每种体系进行3个平行试验。1.5酶的提取和初始化合对正己醇的酶促分解有影响1.5.1粗酶活性测定在1.4.1反应体系中加1.3中(1)、(2)、(3)和(4)提取粗酶液各2mL,按1.4.2中实验方法测定正己醇降解能力。1.5.2蛋白质含量和正己醇降解能力的测定—纯化方法对酶活力影响取2mL粗酶液,分别加入(NH4)2SO4使饱和度达到70%,4℃静置过夜,10000r/min离心30min,沉淀溶于pH值4.6,0.1mol/L柠檬酸缓冲液,经同样缓冲液透析,按1.7.3和1.4.2的方法测定蛋白质含量和正己醇的降解能力。1.5.3聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳参考Laemmli的方法进行。对采用4种方法提取的酶及其70%(NH4)2SO4盐析、透析处理的样品进行电泳分析。聚丙烯酰胺凝胶组成为4%(w/v)丙烯酰胺(浓缩胶)和12%(w/v)丙烯酰胺(分离胶),进样量为20μL。电泳所用电流,浓缩胶20mA、分离胶15mA。剥胶后用120g/LTCA浸泡10min,固定蛋白质样品。染色过夜后进行脱色处理,脱色完毕后用宝生物(Bio-rad)呈像系统分析。1.6酶的初步提取丙酮粉法1.6.1nh42so4的降解提取的酶液参考谢栋的方法,确定最适(NH4)2SO4饱和度。取9个离心管,各加粗酶液2mL,分别加入(NH4)2SO4使饱和度达到20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%和100%,4℃静置过夜,10000r/min离心30min,沉淀溶于pH值5.4,0.1mol/L柠檬酸缓冲液,经同样缓冲液透析,用聚乙二醇6000浓缩,测定每管的蛋白质含量和正己醇的降解能力。1.6.2固相沉淀后2so4-7%饱和度nh42so4-1边搅拌边缓慢在粗酶液中加固体(NH4)2SO4至30%饱和度,4℃静置8h,10000r/min离心10min,弃沉淀,上清液中再加固体(NH4)2SO4至70%饱和度,4℃静置8h后10000r/min离心10min,同1.6.1处理。1.7指标检测1.7.1内标和气相检测反应结束后的待测样,用气相色谱仪(GC9800/FID)按照顶空进样法检测正己醇残留量,以体积分数5%4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液作内标。气相检测用色谱柱为弹性石英毛细管柱DB-WAX-10(ϕ0.53m×30m),载气N2,进样量300μL,采取程序升温,即第1阶段初始温度55℃,初温保持时间3min,升温速率:15℃/min,终止温度200℃,终温保持时间3min;第2阶段,初始温度0℃,升温速率0℃/min,终止温度0℃。1.7.2正己醇降解率测定通过内标法获得对照和样品中正己醇的保留时间和峰面积,以与每个处理相应的对照为基准,计算正己醇降解率。式中,A0为对照的正己醇峰面积;A1为加酶后正己醇峰面积。1.7.3测定蛋白质含量参考文献所述方法,采用考马斯亮蓝G-250法检测粗酶液中蛋白质含量。1.7.4单位蛋白质的正离醇分解量1.7.5酶纯度多样性2结果与分析2.1丙酮法所得粗酶液的活性Prisky等研究发现,在非离子洗涤剂TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)存在的情况下,苹果中的Lox酶的活性减小,说明苹果中的Lox酶可能与细胞膜有关,需采用丙酮等有机溶剂或加入表面活性剂处理的方法提取。而大多数蛋白质均可溶于水、稀盐等溶液中,因此考虑用不同的溶剂提取酶。图1显示了用4种不同溶剂进行提取所得粗酶液及其纯化后蛋白的正己醇降解能力。结果显示,方法(3)和(4)的提取缓冲液中加入TritonX-100或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮),所得酶液的活性均有显著提高。这是因为TritonX-100和PVPP属于非离子型表面活性剂,能够破坏细胞膜的脂膜结构,从而利于膜上酶蛋白的释放。而作为非离子型溶液,丙酮提取所得酶液的活性也比较高,而且在盐析后,其活性远远高于用缓冲液体系提取所得酶液,可能是丙酮为有机溶剂也利于膜上蛋白的释放,提取过程中去除了抑制酶活的糖份(总糖去除率为81.98%)或盐析和透析过程中去除了粗酶中抑制因子的原因。提取所得粗酶液中还含有其它杂质,特别是糖份。这些物质的存在都会给后续的分离纯化带来困难。因此,粗提液中的杂质含量越少越好。在此,重点考察了提取液的含糖量。由图2可以看出,丙酮法所得酶液中糖含量远远低于缓冲液提取体系。这是因为丙酮在提取的过程中还有除糖、脱色、脱脂等作用。不同提取方法所得酶液的特性对比见表1。可以看出,丙酮法所得粗酶液的总正己醇降解活性较差,但其单位酶活很高,是含TritonX-100,PVPP缓冲液的1.10～1.87倍。且丙酮粉法所得酶量较少,仅为5.0g(200g苹果提取)左右。这与李立祥等研究结果类似。考虑到正己醇降解酶的应用,所得酶制剂不仅要考虑酶活性,更要着眼酶制剂本身的活性、体积和应用性。曲拉通法和曲拉通+PVPP法所得粗酶液的活性虽然略高,但酶液体积大,不易贮存,尚需进行浓缩、提纯才能达到应用要求,不利于酶的应用。相对而言,丙酮粉法虽对正己醇降解酶活性有所损失,但纯化倍数最高,加上其酶粉本身活性尚可、体积小和便于贮存、可以直接应用,因此在应用上具有优势。提取方法(2)、(3)和(4)纯化倍数分别为1.12、0.90、0.61,丙酮粉法提取的酶液在经过盐析和透析处理后的酶活性增加幅度最大(增加49.28%)。这与马歇克的研究结果相同。即,在纯化的初始阶段,酶的总活性表现为有所增加。这是因为盐析和透析过程中除去了存在于初始提取物中的抑制因子,或者由于样品中的物质种类繁多而使活性未能呈现出量的线性依赖性。丙酮粉法所得粗酶的蛋白含量低于含TritonX-100,PVPP缓冲体系,但经过初步纯化后,其正己醇降解酶活力最大,且纯化后蛋白含量明显高于纯化前。这说明,用含TritonX-100,PVPP缓冲液体系所得酶液中多出的蛋白主要是杂蛋白,而不是酶蛋白。综合考虑,确定丙酮粉法用于苹果中正己醇降解酶的提取。2.2酶液条带的颜色和颜色要分离纯化未知酶系,首先要确定目标酶的分子量等基本特性。在此,主要考察了粗酶中总蛋白的特性,而且侧重分析了丙酮法所得粗酶液中的蛋白分布。由粗酶的全蛋白电泳图谱(图2)可以看出,丙酮粉法有10个条带,蛋白分子量分布范围较宽,且条带颜色较深,说明蛋白含量较高;其它2种方法所得粗酶中只有3条带,蛋白分子量范围较窄,且条带颜色较浅,说明蛋白含量较少。由此推测,正己醇降解酶可能与细胞粒上的脂类物质结合较紧,需采用丙酮等有机溶剂的方法提取。总体来看,小分子蛋白颜色深,含量较高,而大分子蛋白颜色较浅,含量较少。经过硫酸铵处理过的酶液条带颜色上有所增加,尤其是加入TritonX-100的方法,经过处理后条带数量和颜色均有所增加。据陈惠等研究可知,硫酸铵对酶有显著的保护作用,盐的添加能显著改善酶的热稳定性。因为盐类有离子键作用,当酶的活性中心含有离子作为配位体时,盐离子就能稳定酶的构象。另外,盐作为水分子的替代物占据水的位置,排除自由水对酶造成的不稳定化影响。但曲拉通+PVPP法处理后却减少了,具体的原因还需进一步研究。2.3酶的初步提取2.3.1硫酸铵饱和度对蛋白质分离的影响一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。硫酸铵沉淀常用作实验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种方法进行粗分离。由图3可见,随着硫酸铵饱和度的增加,所得蛋白的沉淀量和沉淀物的酶活均呈先上升后下降的趋势,并分别在硫酸铵饱和度60%和70%时达到最大值。硫酸铵饱和度小于30%时,蛋白沉淀量和沉淀物的酶活都很低。硫酸铵饱和度为60%时所得蛋白质的沉淀量虽然最大,但其酶活并未达最大值,说明此时沉淀下来的蛋白质主要是杂蛋白。综合考虑,选用硫酸铵饱和度为30%～70%。2.3.2丙酮粉法提取酶nh42so4盐沉淀分析对粗酶提取液进行分级沉淀,结果发现分级沉淀所得蛋白的正己醇降解率为88.56%±0.985%,说明条件选择合适。3讨论和结论3.1苹果期内正己醇降解酶的作用效果及展望(1)通过酶法转化降解正己醇含量具有专一性强、无毒副作用、对环境友好等优点,在提高食品