奶牛乳中酮体检测方法的对比研究

奶牛乳中酮体检测方法的对比研究

牛奶酮病是由体内营养物质和养分代谢障碍引起的一种全身功能障碍的营养代谢性疾病。它的特点是血糖浓度降低、血液、尿液和乳房中的酮体含量增加，导致酮综合征、酮尿症和酮乳症。近年来,随着我国奶牛业的发展和奶牛单产水平的不断提高,奶牛酮病特别是隐性酮病也越来越严重,酮病能够导致奶牛产奶量显著下降,乳成分变化,奶牛出现产后发情延迟,屡配不孕等,给奶牛业带来了相当大的损失。奶牛隐性酮病没有明显的临床症状,但其发病率超过临床酮病10~20倍。检测奶牛血液酮体含量能够判定奶牛是否患有酮病,但由于血样的采集操作不便,会给奶牛造成应激,限制了其在奶牛生产中的应用。有研究发现,荷斯坦奶牛血液、尿、乳中酮体含量存在显著的相关性,一般认为乳酮含量超过10mg/dL,即有隐性酮病。因此,通过检测乳酮含量进行奶牛酮病的监测,对于指导奶牛生产具有很好的意义。本试验在南京地区某奶牛场进行采集奶样,测定其酮体含量,比较不同泌乳时间、产奶水平、日粮结构等,找出酮病发生和产奶量、泌乳时间、日粮能量等之间可能的相关性,为奶牛场、临床兽医和养牛专业户早期发现和诊断酮病提供依据,使奶牛的隐性酮病发病率下降,从而增加经济效益。1材料和方法1.1试验设计与饲料试验奶牛:南京地区某奶牛场40头奶牛,分为3组,并分别标号。其中高产奶牛20头,日产奶量在30kg以上;中产奶牛10头,日产奶量在20kg~30kg;低产奶牛10头,日产奶量15kg左右。样品采集:本试验分别于2007年11月13日、12月11日及2008年3月18日分3次采集该奶牛场40头已选荷斯坦奶牛的奶样和饲料样。乳样采集是弃去刚挤出的奶,然后接取乳样装于干净塑料瓶内,每头奶牛的奶样大概为150mL。采集后的乳样立即送南京农业大学草食动物实验室4℃下保存,进行奶样酮体含量的检测;饲料样采集后,在实验室进行65~70℃烘干预处理,粉碎进行饲料总能的测定。DHI资料的收集:在奶牛场收集已选定的40头奶牛3个月的DHI资料,根据奶牛DHI资料,分析奶牛隐性酮病发生机理和可能的原因。1.2测定总酮含量的方法酮体定性:对酮体定性检测的方法有很多种,本试验采用试剂法(累加耳试验)、酮粉法、列斯法和乳酮法。酮体定量:采用水杨醛比色法测定总酮体含量。将样品中的乙酰乙酸、B-羟丁酸转化为丙酮后,测定样品中的丙酮总量,其主要步骤为除蛋白、蒸馏、水杨醛显色及比色等。饲料能量测定:采用氧弹式热量计进行日粮总能的测定。1.3数x标准差sd的表示应用统计软件SPSS16.0对乳中酮体含量的测定结果进行统计分析,以平均数(X)±标准差(SD)表示。根据资料报道和本次测定结果,按通常的标准,乳酮在10mg/dL(1.722mmol/L)以下为酮体正常值。对被检牛乳中的乳酮值和日粮能量水平,进行显著性检验和相关性分析。2结果与分析2.1酮体测试的结果2.1.1乳酮法和酮粉法检测效果比较由表1可见,利用4种定性方法判定奶样酮体阳性率,酮粉法检出率(16.67%)高于其他3种方法的检出率(分别为8.33%、8.33%、5.83%)。而乳酮法检测的效果最不明显,阳性检出率只有5.83%。对于易发生隐性酮病的高产奶牛来说,酮粉法检测的效果也是最明显的,酮病阳性检出率为25%,而用试剂法(13.33%)、列斯法(11.67%)、乳酮法(5.00%)检测效果都较酮粉法要低。对于中、低产(日产奶量30kg以下)的奶牛,其隐性酮病的发病率较高产奶牛要低。2.1.2不同产牛奶乳酮含量的比较对3次采样结果进行综合处理(除去缺失或未检测的奶样),样品数共有89头份,其中高产40头份,中产24头份,低产25头份,泌乳牛酮体含量见表2。从表2可知,中产、低产奶牛与高产奶牛的乳酮含量差异均极显著(P<0.01),说明在高产奶牛中,乳酮的含量较中低产奶牛要高,其隐性酮病的发病率也较高。而中产奶牛和低产奶牛酮体含量差异极显著(P<0.01)。乳酮含量在高、中、低奶牛群体中,均表现为差异极显著,说明酮体含量水平和泌乳量有关。2.2饲料能量与酮病的相关分析2.2.1高产牛奶中患隐性酮病的日粮能量水平相关性分析若干酮病奶牛,检测这些奶牛平均的酮体含量(见表3)。根据高产奶牛日粮能量水平,分析高产奶牛中患隐性酮病的奶牛和其日粮能量水平的相关性,发现高产奶牛中患隐性酮病的奶牛和其日粮能量水平相关系数为-0.51,呈负相关。2.2.2日粮能量水平对乳状液中隐性酮病发生率的影响对不同产奶水平下隐性酮病奶牛进行分析,由表4可知,日粮的能量水平不仅仅影响高产奶牛的隐性酮病发生率,而且对整个奶牛群体的酮病发生情况影响也较强,其相关系数为-0.846,呈现极强的负相关,表明该奶牛场奶牛群体酮病的发生很依赖于日粮能量水平,日粮能量水平越低,奶牛特别是高产奶牛的隐性酮病发生率越高,能量水平越高,酮病发生率越低。2.3高产牛奶中患隐性酮病的情况通过对收集所选40头奶牛3次DHI资料,除去缺失或未检测的奶牛,资料总计98份,根据奶牛隐性酮病的监测,对各泌乳月的奶牛酮病发生情况分析表明:奶牛产后酮病的发生大部分集中在2个泌乳月内,发病率高达46.15%;其他各泌乳时间内的隐性酮病发病率较2月内低(见表5)。分析高产奶牛中患隐性酮病的奶牛和其泌乳时间的相关性,发现高产奶牛中患隐性酮病的奶牛和其泌乳时间相关系数为-0.764,呈负相关。故在奶牛泌乳早期,要密切注意奶牛的采食情况及能量摄入,及时进行奶牛隐性酮病监测,尽量减少酮病的发生。3讨论3.1酮粉法定性检测奶牛隐性酮病的临床诊断较为困难,寻找快速、准确、实用的早期诊断方法一直是研究奶牛酮病的热点。有研究指出酮粉法可用于乳酮的检测,并可作为酮病早期诊断的方法。本次试验也发现酮粉法定性检测较准确,乳酮阳性以上的15头牛中,有10头定量予以确认,另5头乳酮含量也接近10mg/dL。酮粉法定性检测酮体虽具有方便、快捷等优点,但因所使用的试剂容易吸潮,必须保存在干燥的棕色玻璃瓶中。本试验分别对高、中、低产奶牛的酮病监测表明,结合水杨醛比色法,有利于提高酮粉法定性检测的灵敏性、准确性,并有利于早期诊断。3.2日粮能量水平和泌乳时间与乳状“n”的关系通过对DHI资料的综合分析,发现该场高产奶牛隐性酮病的发病率仍然较高。从泌乳时间上看,仍以泌乳60d以内的奶牛较多,这与Geishauser和Melendez报道的一致。从本研究来看,日粮能量水平和泌乳时间都与奶牛隐性酮病的发生有较强的相关性。因此,加强奶牛产前产后的饲养管理,并在2个泌乳月内做到定期监测,对控制隐性酮病的发生具有重要意义。Bareille研究也发现,奶牛隐性酮病与泌乳时间有关。所以,产前通过加强饲养管理、调整合理的日粮搭配,分娩后重视隐性酮病的监测,提高奶牛干物质(尤其是生糖物质)摄食量,防止奶产量上升过快,可有效预防酮病的发生。3.3日粮能量水平对乳酮的影响从生化角度来说,酮病的发生与能量代谢密切相关。反刍动物体内的能量代谢主要是丙酸和葡萄糖的代谢。体内能量大多来自丙酸和葡萄糖,在泌乳时葡萄糖大多被奶牛利用合成乳糖。而丙酸则参与奶牛的脂肪代谢,当奶牛产奶的能量(主要是乳脂)需要超过其食入的能量时,奶牛就开始动用体脂,脂肪首先被分解为非酯化脂肪酸(NEFA),并且运送到肝脏。在肝脏,NEFA被分解为乙酸,产生的乙酸被彻底分解为二氧化碳和水以生成更多的能量,如果该过程没有足够的丙酸和葡萄糖可被利用,过多的乙酸就会在肝脏中聚集,乙酸分子能在酶的作用下转化为丙酮、乙酰乙酸和β-羟丁酸,这些产物进入血液和乳汁中,蓄积到一定水平而引起酮病症状。奶牛群体酮病的发生依赖于日粮能量水平,日粮能量水平越低,奶牛特别是高产奶牛的隐性酮病发生率越高,能量水平越高,酮病发生率越低。对该牛场的隐性酮病的监测表明,其隐性酮病的发生率较低,说明该牛场整体能量水平能满足奶牛产奶需要,但高产奶牛的隐性酮病发生率较整体高,说明高产奶牛的日粮能量水平不能满足产奶需要。对所选40头奶牛的乳酮水平和日粮能量水平的综合监测表明,其整体的乳酮酮体水平远低于隐性酮病酮体水平(10mg/d