《中国药典》疗法中疗法定刺成分的含量

《中国药典》疗法中疗法定刺成分的含量

这种复杂的多酚类化合物，是一种复杂的水下双酚类化合物。广泛分布于植物材料，如五倍子、贯草、儿茶等。近年来,对鞣质生理活性的研究方兴未艾。研究表明,鞣质能清除生物体内过剩的自由基,维护细胞膜的流动和蛋白质的构象,防止辐射诱发的DNA断裂,从而在抑制脂质过氧化、心血管病、抗癌、抗突变、抗衰老、抗白内障等方面有独特功效。鞣质的经典含量测定方法有很多种,如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、高锰酸钾法、干酪素法、络合量法。皮粉法是国际公认的鞣质含量测定方法。皮粉的主要成分是蛋白质,鞣质可通过分子中的酚羟基与蛋白质的酰胺基形成氢键而结合成不溶于水的沉淀,以重量法测定含量。《中国药典》一部鞣质含量测定法一直沿用皮粉法,适用范围广。缺点是耗用样品多,测定时间长,且没有选择性,测定结果偏高,而且皮粉用量很大。近年来,皮粉试剂的供应和质量都很难保证,使皮粉法的应用受到很大限制。《英国药典》2002版鞣质测定法附录采用的是磷钼钨酸-皮粉比色法,即利用鞣质在碱性溶液中将磷钼钨酸还原,产生深蓝色,其吸收度与含量成正比,采用比色法测定。其中,以焦性没食子酸为对照,测定总酚和不被皮粉吸附的酚,二者之差计为鞣质的含量。罗文毓等报道了改进的干酪素法,其关键步骤是以干酪素代替皮粉,采用磷钼钨酸比色法测定;药材样品提取采用浸泡过夜代替加热回流提取等。本文参照《英国药典》和干酪素法,重点对提取方法、显色剂、干酪素用量等进行了比较,提出了鞣质含量测定方法,为药典相关附录方法的修订提供了实验基础。1试剂与药品化学品岛津UV-2100,2201紫外分光光度计,Agilent8453紫外分光光度计;钨酸钠(分析纯,广东汕头西陇化工厂)、钼酸钠(分析纯,北京化学试剂公司)、硫酸锂(分析纯,天津天河化学试剂厂)、无水碳酸钠(分析纯,北京化学试剂公司);磷酸(北京化学试剂公司)、盐酸(北京化学试剂公司)均为分析纯;干酪素(生化试剂,北京双旋微生物培养基制品厂);焦性没食子酸(分析纯,贵州遵义市建强化工厂);鞣酸(遵义,北京化学试剂商店分装);没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0831-9501);五倍子、地榆药材(均为徐继民药师采自吉林通化、河北张家口等地或购自中药材市场,并进行鉴定)。2实验方法2.1种比色液最大吸收波长测定结果取对照品、总酚和不被吸附的多酚比色液,在400～1000nm波长测定,结果三种比色液均在760nm具最大吸收。因此,确定测定波长为760nm。2.2加热和冷浸提取两种方法的比较《英国药典》2000版鞣质测定法药材供试液提取方法采用加热提取,罗文毓等报道,鞣质遇热不稳定,采用室温浸提过夜的方法操作简单,提取完全。本试验对加热和冷浸提取两种方法进行了比较,结果见表1。结果表明,冷浸过夜提取测定含量高于加热提取法,且操作较简单。因此,附录正文采用室温浸提过夜的提取方法。2.3皮粉法和干酪素法《英国药典》法采用皮粉作为吸附剂测定不被吸附的多酚类。参考文献干酪素对鞣质的吸附更具专属性,即可选择性吸附有生理活性鞣质,而鞣酐等非活性鞣质则不被吸附,选择性较皮粉法高。以鞣酸为例,试验分别采用皮粉和干酪素为吸附剂,测定含量。结果皮粉法测定值为81.18%,干酪素法测定值为62.26%。2.4干结构测定样品的制备试验考察了干酪素的用量对测定结果的影响。结果见表2。结果表明,对于测定样品,三倍取样量的干酪素用量基本可吸附完全。试验使用干酪素0.6克。2.5照照剂的确定《英国药典》2000版鞣质测定法附录采用焦性没食子酸为对照品,试验表明焦性没食子酸很不稳定,溶液在室温放置很快变色,必须新鲜配置使用。考虑到没食子酸具有相似的结构和显色行为,且已有含量测定用对照品,可以作为鞣质含量测定对照物质。实验比较了焦性没食子酸和没食子酸分别作为对照的测定情况。以鞣酸含量测定为例,采用不同对照物比较测定结果:以没食子酸对照,测得含量平均值为62.26%,以焦性没食子酸对照,测得含量平均值为45.45%。以没食子酸对照,含量值较高。3方法学的检验3.1线性关系研究本法为标准曲线法,每次测定均随行测定,现举3次测定数据,表示线性关系情况,见表3。3.2重复试验取样品6份,按正文方法测定,测得含量结果见表4。3.3加样回收率测定取同一样品4份,分别精密称取约75mg,置250ml量瓶中,分别精密加入鞣酸溶液(以没食子酸计含量为62.26%)50ml,加水100ml,按供试品溶液制备方法制备,并按总酚和不被吸附的多酚测定法分别测定含量,计算回收率。结果见表5。4样品测定4.1对照品溶液的制备精密称取没食子酸对照品50mg,置100ml棕色量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。4.2磷鳌锑酸溶液的稀释精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml,分别置25ml棕色量瓶中,各加入磷钼钨酸试液1ml,再分别加水11ml、10ml、9ml、8ml、7ml,用29%碳酸钠溶液稀释至刻度,摇匀。以相应的试剂为空白,照分光光度法(附录ⅤB),30分钟后,在760nm波长处测定吸收度,以吸收度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。4.3供试品溶液的制备取五倍子、地榆药材,粉碎,过三号筛,分别称取0.15g和0.75g,精密称定,置250ml棕色量瓶中,加水150ml,放置过夜,超声处理10分钟,放冷,用水稀释至刻度,摇匀,静置(使固体物沉淀),滤过,弃去50ml初滤液,精密量取续滤液20ml,置100ml棕色量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。4.4加样中没食子酸的量总酚测定精密量取供试品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加入磷钼钨酸试液1ml”起,加水10ml,同法测定吸收值,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg),计算,即得。不被吸附的多酚测定取供试品溶液25ml,加至已盛有0.6g干酪素的100ml具塞锥形瓶中,密塞,置30℃水浴中保温1小时,时时振摇,取出,放冷,摇匀,滤过,弃去初滤液,精密量取续滤液2ml,置25ml棕色量瓶中,照标准曲线制备项下的方法,自“加入磷钼钨酸试液1ml”起,加水10ml,同法测定吸收值,从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg),计算,即得。鞣质含量=总酚量-不被吸附的多酚量样品测定结果见表6:5测定条件的改进5.1本法主要参考了《英国药典》鞣质测定法附录方法。经过实验,主要在以下四个方面进行了改进:(1)《英国药典》法采用单点对照计算方法。比色法含量测定受到的影响因素较多,实验表明线性曲线有明显的截距值。在同样测定条件下,单点对照计算结果偏高,标准曲线法测定结果的准确性较好。因此,本法改为采用标准曲线测定方法。(2)《英国药典》法采用焦性没食子酸为对照品,计算含量。鉴于焦性没食子酸不稳定的性质,本法改用没食子酸作为对照物。(3)实验比较了皮粉和干酪素吸附的测定结果,皮粉吸附的测定值明显高于干酪素吸附,表明干酪素的吸附作用更具专属性。(4)《英国药典》法皮粉吸附步骤是在样品浓溶液阶段,10ml溶液加0.2克皮粉吸附后,滤过液量很少,再精密吸取2ml稀释,操作难度较大,且总酚测定和不被吸附的多酚测定需两次精密稀释操作。本法改为取样品提取液25ml,定容至100ml制成稀释液,取25ml进行干酪素吸附步骤,滤过后,溶液直接用于测定。不仅减少了精密稀释步骤,吸附液的量也足够进行移液管的清洗等使用。5.2《中国药典》鞣质含量测定法一直沿用皮粉法,该法