异硫氰酸胍玻璃粉法提取病毒rna的研究

异硫氰酸胍玻璃粉法提取病毒rna的研究

冠状病毒是一种严重的急性呼吸综合征（ss）的病原体。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)在感染早期即可检测到病毒RNA,是SARS早期诊断的首选方法。为了提高检出率,国内外一般采用QIAGEN公司生产的病毒RNA提取试剂盒,该试剂盒价格非常昂贵,很难在临床上常规应用。我们建立了一种快速简便提取SARS冠状病毒RNA的方法,现报道如下。1材料和方法1.1总rna提取24例SARS患者均为北京某医院的住院患者,发病时间为5～20d,同时采集患者粪便和痰液。将1g粪便溶于1ml生理盐水中,振荡混匀,5000r/min离心10min,取上清提取病毒RNA。痰液加等量10g/L乙酰半胱氨酸,室温振荡1h,充分液化后提取病毒RNA。临床标本的前期处理和病毒RNA的提取均在BSL-3实验室中进行。1.2tri能力有析具体操作步骤如下:(1)在0.1ml标本液中加入异硫氰酸胍-玻璃粉裂解液(4.7mol/L异硫氰酸胍,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris-HClpH6.4,1%TritonX-100和玻璃粉10g)0.9ml,混匀,室温作用10min,6000×g离心1min。(2)弃上清,加异硫氰酸胍漂洗液(4.7mol/L异硫氰酸胍和100mmol/LTris-HClpH6.4)1ml,混匀后6000×g离心1min。(3)弃上清,加70%乙醇1ml,混匀后6000×g离心1min。(4)弃上清,将塑料离心管倒置,37℃烤干10～15min。(5)加入DEPC处理的去离子水50μl洗脱RNA,振荡混匀后6000×g离心1min,取上清即可作为RT-PCR的模板。1.3过滤柱的添加操作按照说明书进行,具体操作步骤如下:(1)在1.5ml塑料离心管中加入AVL560μl,然后加入标本液140μl,混匀后室温作用10min。(2)加入无水乙醇560μl。(3)混匀后分两次加入过滤柱中,每次加630μl,8000r/min离心1min。(4)加入AW1液500μl,8000r/min离心1min。(5)加入AW2液500μl,14000r/min离心3min。(6)最后加入60μlAVE液,8000r/min1min将RNA洗脱下来作为模板用于PCR扩增。1.4rt-pcr1.4.1离心条件下dntp1l在Eppendorf管中加入9μl病毒RNA提取液和1μl引物BNIoutAs(引物序列均为WHO公布序列,参见文献1),95℃3min,4℃1min,离心后加入5×FirstStrandBuffer4μl、0.1mol/LDTT2μl、10mmol/LdNTP1μl、RNA酶抑制剂1μl、SuperscriptⅡ1μl、去离子水1μl,42℃45min,75℃7min。1.4.2niss2和bniss3反应体系:10×缓冲液2μl、2.5mmol/LdNTP1μl、引物BNIoutS2和BNIoutAS各1μl、Taq酶1U、cDNA2μl、去离子水12.8μl。反应条件:95℃3min,94℃40s,54℃40s,72℃40s,35个循环,72℃延伸3min。1.4.3pcrpcr反应体系:10×缓冲液2μl、2.5mmol/LdNTP1μl、引物BNIinS和BNIinAS各1μl、Taq酶1U、第一轮PCR产物2μl、去离子水12.8μl。反应条件:同第一轮PCR。1.4.4结果分析第二轮PCR产物在含EB的10g/L琼脂糖凝胶中电泳,紫外分析仪下观察结果,在109bp处出现特异条带为阳性。2结果2.1不同清洗时间对从异硫氰酸脱水物中提取病毒rna的影响表1显示室温和80℃两种洗脱温度下RT-PCR检出率的差别,所有在室温时阳性的粪便和痰液标本在80℃时也均阳性。2.2异硫氰酸凝胶法与齐格纳试剂盒rt-pcr的检出率之比采用异硫氰酸胍-玻璃粉提取法阳性的粪便和痰液标本采用QIAGEN试剂盒提取后也均阳性(见表2)。3洗脱温度和时间为了提高SARS冠状病毒RNA的PCR检出率,除采用套式PCR和荧光标记引物等措施外,另一个重要措施就是采用灵敏可靠的病毒RNA提取方法。QIAGEN公司生产的病毒RNA提取试剂盒昂贵的价格限制了其在我国临床上的推广应用。本文参考国内外一些相关文献,建立了异硫氰酸胍-玻璃粉法提取SARS冠状病毒RNA的方法,研究发现适当增加洗脱温度可以提高病毒核酸的检出率。采用此方法与QIAGEN公司生产的病毒RNA提取试剂盒平行检测了24例SARS患者的粪便和痰液标本,结果显示两种方法的RT-PCR阳性率基本相同,前者略低于后者。Rasool等人报道的研究方法是分两次洗脱病毒核酸,将两次洗脱液合并后使用乙酸铵和乙醇沉淀后再用DEPC处理水溶解。我们的实验结果证实洗脱液进一步采用乙酸铵和乙醇沉淀后可以提高病毒核酸检出率。郭乃洲等人的研究结果也证实异硫氰酸胍裂解异丙醇沉淀法操作简单,具有较好的敏感性和特异性。异硫氰酸胍-玻璃粉法的成本明显低于QIAGEN试剂盒,仅为QIAGEN试剂盒的十分之一,操作时