14生物检定金叶省名师优质课赛课获奖课件市赛课一等奖课件

第六章生物检定法第1页

主要内容第一节概述第二节生物检定质反应直接测定法第四节生物检定法应用第三节生物检定量反应平行线测定法第2页第一节概述五.生物检定惯用方法二.生物检定应用范围三.标准品四.生物检定中基本概念一.生物检定法介绍六.生物检定步骤七.生物统计知识第3页

一

生物检定法介绍1.什么是生物检定法？

待检药品被测物相对效力（效价或毒性）有效性安全性生物体标准品活性反应动物组织细胞微生物利用药品对生物体作用以测定其效价或生物活性一个方法第4页相对快速、重复性好、不能反应药品生物特异性和有效性反应药品生物特异性和有效性

繁琐、误差大2.生物检定采取试验方法

定量、半定量、定性

药品生物效价、安全检验、判别

体外测定

(invitro)离体器官、组织,微生物,酶和细胞

体内测定

(invivo)

整体动物

类别第5页3.生物检定法特点

以药理学反应为基础(定量药理学—剂量和反应函数关系)以标准品对比校验为伎俩（在产生特定反应情况下，以供试品与标准品剂量比值推算供试品效价）以生物统计学方法为结果判断依据真正活性测定，与理化分析、蛋白结合试验不一样；但生物差异性大（试验误差大）、专业性强、试验周期长，人力、物力消耗大，计算较繁。第6页控制生物差异性方法与办法:生物起源、喂养或培养条件必须均一。采取特定试验设计,对影响试验误差条件和因子进行限制,降低试验误差。用生物统计方法提升试验可靠性。第7页应用范围342药品效价测定1微量生理活性物质测定一些有害杂质程度检验中药质量控制二生物检定法应用范围第8页多组分生化药品制剂、激素类药品、生物制品:

由结构类似、而生物活性不一样、百分比不定各种成份组成，或其组分不明确、结构复杂，难用理化方法反应其生物活性；虽可用理化方法测定含量，但含量不能完全反应效价（生物检定是反应产品质量主要指标，含有专属性。当前英国、美国及中国药典都有收载）药品效价测定第9页肝素天青A显色比色法测定

×（但变性肝素同时显色，不能反应肝素活性）所以:肝素抗凝血活性√第10页生化药品肝素、胰岛素、缩宫素、绒促性素、硫酸鱼精蛋白、精蛋白锌胰岛素、卵泡刺激素、黄体生成素、降钙素、生长激素、升压素等21个品种（约占我国生化药10%）抗生素生物制品

菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素等药典生物药品效价测定品种:第11页应用范围342药品效价测定1微量生理活性物质测定一些有害杂质程度检验中药质量控制二生物检定法应用范围第12页

无菌、微生物程度、热原、细菌内毒素、异常毒性、降压物质、过敏等

药典几百种有害杂质程度检验第13页应用范围342药品效价测定1微量生理活性物质测定一些有害杂质程度检验中药质量控制二生物检定法应用范围第14页

一些神经介质，激素等微量生理活性物质，因为其很强生理活性，在体内浓度很低，加上体液中各种物质干扰，极难用理化方法测定。

而不少活性物质生物测定法因为灵敏度高、专一性强，对供试品稍作处理即可直接测定。

如乙酰胆碱，5-羟色胺等活性物质测定。微量生理活性物质测定第15页应用范围342药品效价测定1微量生理活性物质测定一些有害杂质程度检验中药质量控制二生物检定法应用范围第16页中药成份复杂，大部分中药有效成份还未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础生物测定方法来控制其质量。中药质量控制第17页三标准品(S)与供试品(T)及其表示标准品（S）：系指用于生物检定中效价测定标准物质，以效价单位(U)表示。

PS表示S效价国家标准品：系指用国际标准品标定用于定量测定某一制品效价或毒性标准物质，其生物活性以国际单位（IU）或以单位（U）表示。

第18页

供试品（T）

供试品(T)是供检定其效价样品,它活性成份应与标准品基本相同。

AT是T标示量或预计效价

PT是经检定T效价,称“测得效价”第19页

效价是表示药品效力强弱或活性物质含量一个公认剂量单位。效价单位（U）是衡量生物药品有效成份效力详细尺度。效价:用每毫升或每毫克中含有某种生物药品效价单位数表示药品效力或浓度单位U/mg，U/mL

比如:

青霉素钠效价为1670U/mg

庆大霉素效价为590U/mg

洋地黄效价为10U/mL

效价单位(效应浓度单位)第20页四.效价检定中基本概念（一）生物反应（生物检定基础）（二）剂量与反应关系（三）等反应对比检定第21页（一）生物反应（生物检定基础）

药物

生物学定量法

胰岛素

小鼠血糖降低法小鼠惊厥法

肝素

家兔血凝时间法

抗生物

微生物生长抑制法

生物制品

动物保护力活菌数和活病毒滴度

生长激素

去垂体大白鼠体重法第22页（二）剂量与反应关系生物反应类型质反应：给药后,观察某一反应某一程度出现是否。如是否死亡、是否惊厥，是质改变，称质反应。量反应：药品对生物体所引发反应伴随药品剂量增加产生量变能够测量者,称量反应。如血压、血凝时间、血糖等。第23页剂量与反应关系某降压药：剂量降压作用

1μg15mmHg2μg25mmHg3μg30mmHg剂量与反应间普通呈曲线关系第24页

剂量与反应关系直线化剂量与反应间普通呈曲线关系将剂量取对数(lgd)后可与反应(y)成直线关系生物检定中剂量惯用对数表示第25页

将药品供试品（T）和已知效价标准品（S）对生物体进行同时对比，以对T效价（或毒力）进行检定方法。属于对比检定。

（三）等反应对比检定

（相对效力计算）

S—dS

（标准品剂量）；PS

（标准品效价）

T—dT

（供试品剂量）；PT

（供试品效价）

常以产生等反应时效价比值R得出R=PT/PS第26页

对于量反应：

S和T各自对数剂量和反应应呈直线关系

S和T两条直线应平行

等反应对比检定原理

lgdS=XSlgdT=XTM=lgdS-lgdT=XS-XTS与T等反应时所对应剂量分别为：第27页等反应时:S和T中所含效价应相等，即：

dT·PT=dS·PS（S和T中所含效价单位数）令：

R=PT/PS=dS/dT

（1）

∴PT=R·PS

（2）

求出R就能够求出PT

（R为等反应效价比值）第28页（1）式两边取对数，lgR=lgPT/PS=lg(dS/dT)=lgdS-lgdT

令lgR=M,lgd=X,则对数效价比值：

lgR=M=lgdS-lgdT=XS-XT

R=lg-1M=lg-1

(XS-XT)

PT=R·PS=lg-1M·PS实际工作中S剂量常按已知效价计算，而T剂量按标示效价或预计效价（AT）来安排:

PT=R·AT

R=PT/PS=dS/dT

（1）第29页五生物检定惯用方法(一)质反应直接测定(二)量反应平行线测定法第30页六生物检定步骤试验设计选择反应指标测定试验可靠性检验(方差分析)相对效力计算及可信限预计第31页七.生物统计知识

（试验设计及方差分析）（四）试验可靠性检验（方差分析)（一）试验设计目标（二）试验设计主要三原則（三）生物检定惯用试验设计第32页1.试验设计目标最少代价取得最多信息可有效排除混杂变异对结果影响便于采取简化计算

(采取定型对称设计有利于有效性检验简化)采取特殊试验设计

(提升精度和灵敏度)第33页标准曲线法与量反应平行线4.4法测定

LMWH产品抗FXa效价比较标准曲线法结果误差大,重现性差,波动大,缺乏可比性；当采取量反应平行线原理4·4试验设计,结合生物统计,其结果较平稳,误差小,重现性好。第34页2.试验设计主要三原則重复随机对照

如：试验某种降压药品降压作用：将20只雄性大鼠随机分成两组，每组10只，一组作为空白对照，一组给予待测药品。第35页

完全随机化设计随机区组设计交叉试验设计3.生物检定惯用试验设计第36页

(1)完全随机化设计动物号12345678910随机号1203874596组别甲乙乙甲乙甲乙甲甲乙

将10个观察对象随机分为两组：例：洋地黄效价测定——鸽最小致死量(MLD)法单号为甲组，双号为乙组第37页(2)随机区组设计区组处理ABCD一1432二5687三1091211四16141315五19181720六23222124七28272625八30312932将分成8各区组（如来自8个窝动物）32个受试者随机分配到A,B,C,D四个处理组各区组中受试者被随机分配接收不一样处理例：催产素生物检定法——大鼠子宫法第38页动物编号1234第一次STST第二次TSTS(3)交叉试验设计S为标准品组，T为供试品组平衡试验次序影响。把不一样原因不一样水平均摊于受试对象，去除试验时间次序和试验次序影响例:小鼠血糖法测定胰岛素效价处理在同一受试对象上重复观察，因为处理是在同体上比较，从而防止了个体差异。第39页(4)方差分析(F检验)

①

方差分析概念

用于推断多个总体均数有没有差异(差异显著性)检验方法如：观察四种降压药对大鼠降压效果或观察四个剂量降压药对大鼠降压效果第40页②方差S2：是测量值在其总体均值周围分布情况一个量度，方差表征随机变量分布离散程度。方差S2==f

=n-1自由度离均差∑(yi-)2fSSf方差S2==f

=n-1fSSf方差S2==差方和SSf

=n-1fSSf方差S2==f

=n-1fSSf方差S2==f

=n-1fSSf方差S2==f

=n-1f

SSf第41页组间变异总变异组内变异组间变异（处理效应）用组间方差表示；组内变异（随机误差）用组内方差表示。③方差分析原理

S2总=S2处理

+S2误差第42页

s2总=s2处理

+s2误差

④

方差和F值计算方法

SS总=SS处理

+SS误差

f总=f处理

+f误差

SS误差=SS总－SS处理

f误差=f总－

f处理

s2总=SS总/f总；s2处理

=SS处理/

f处理

s2误差=SS误差/f误差第43页误差项S2F值=处理效应方差S2

SS处理f

SS误差f=方差分析（F检验）:

以处理组方差(S2)与误差项方差（S2（误差））比值（称F值）来确定处理效应差异显著性程度。

查F值表，当F计算值大于P＝0.05或P＝0.01查表值时，则P＜0.05或P＜0.01，即为在此概率水平下该项变异有显著意义。第44页⑤方差分析(F检验)步骤建立检验假设：无效假设把处理间方差μ12与误差方差假设相等即：H0：μ12=μ22

；备择假设HA：μ12≠μ22计算各处理组方差及组内方差，求出对应F值。计算所得F值与F表中按一定自由度查得F0.05或F0.01进行比较若处理组F＞F0.05（F0.01）则拒绝H0，接收HA，认为该处理所引发差异有显著（极显著）意义。若处理组F＜F0.05则接收H0，认为该处理所引发差异无显著意义。第45页

主要内容第一节概述第二节生物检定质反应直接测定法第四节生物检定法应用第三节生物检定量反应平行线测定法第46页第二节质反应直接测定一.测定程序

将试验对象随机分成两组，S组与T组，分别测定两组

MED（最小效量）——y值计算出M、R和PT

预计试验误差（用可信限（FL）表示）在较短时间内能准确测得各个动物对S和T最小效量方法。以产生质反应最低有效量(MED)为反应指标（y）第47页

按公式计算出M，再求算R和PT：

R=lg-1MPT=R·AT二.M和PT计算R=

PT/PS=dS/dT第48页误差项方差S2计算三.试验误差预计（用可信限（FL）表示）步骤：标准误SM计算可信限（FL）计算第49页1.误差项方差S2计算S2=(∑XS2－)+(∑XT2－）(∑XS)2nS(∑XT)2nTnS+nT-2nS、nT为标准品和供试品反应个数第50页2.标准误SM计算

是指平均数标准差,即各均数之间差异大小,用SM表示,SM越小差异也越小。S

2为误差项方差nS、nT分别为标准品和供试品反应个数用SM对总体均数进行评定，计算可信限。第51页

标志检定(R和PT)结果准确度

RFL=lg-1(M±t·SM)PTFL=AT·lg-1(M±t·SM)

t(f,0.05)：依据f和概率水平查表取得R或PT高限-R或PT低限2R或2PT3.可信限（FL）计算R或PTFL%=×100%除药典另有要求外，可信限率不得大于5%。第52页4.示例:质反应直接测定法

洋地黄效价测定——鸽最小致死量（MLD）法本法系比较洋地黄标准品(S)与供试品(T)对鸽最小致死量(MLD，U/kg)，以测定供试品效价。

第53页试验方法：

标准品稀释液配制标准品溶液

(S)0.9％氯化钠1→30稀释(使MLD在25～34ml)供试品溶液和稀释液配制供试品(T)按AT配制和稀释(AT=10U/g)使鸽与S靠近第54页检定法按直接测定法计算效价(PT)及试验误差FL(％)本法可信限率FL(％)不得大于15％。

鸽(250～400g)标准品组

(6只)供试品组

(6只)注射S至死亡MLDS(U／Kg)MLDT

(U／Kg)注射T至死亡第55页STMLDS（dS）XSXS2MLDT(dT）XTXT2U/kg体重Lg(dS×10)U/kg体重Lg(dS×10)1.151.0611.1261.111.0451.0921.011.0041.0081.231.0901.1881.101.0411.0841.061.0251.0511.141.0571.1171.311.1171.2481.061.0251.0510.940.9730.9470.950.9780.9561.361.1341.286∑XS6.166∑XT6.384XS1.028XT1.064

测定结果(∑X)2

38.019

40.755

∑X26.3426.811第56页

效价计算

M==1.028-1.064=-0.036

R=lg-1M=antilgM=antilg(-0.036)=0.9204

PT=R·AT=0.9204×10U/g=0.9204U/g已知：XS=1.028；XT=1.064；AT=10U/g第57页

误差项S2及可信限计算S2=(∑XS2－)+(∑XT2－）(∑XS)2nS(∑XT)2nTnS+nT-2=0.002373已知：

∑XS2=6.342

∑XT2=6.811

(∑XS)2=38.019

(∑XT)2=40.755nS=nT=6第58页＝0.02812

R

FL=lg-1(M±t·SM)

查t值表t(10)0.05=2.23（P=0.95）lg-1(M+t·SM)是R高限;lg-1(M-t·SM)是R低限

PTFL=AT·

lg-1

(M±t·SM)

AT·lg-1(M＋t·SM)是PT

高限；

AT·lg-1(M－t·SM)是PT低限

PTFL=7.97～10.6(U/g)第59页

PT

FL%=10.6-7.972×9.20×100%=14.3%R(或PT)

FL%=R高限(或PT高限)-R低限(或PT低限)2R（2PT）×100%结果PT

FL%＜15％，试验结果可靠。第60页直接测定法优点：

可使用较少许动物，直接测得S和T等反应剂量直接测定法惯用试验设计：

随机设计配对交叉设计小结第61页

主要内容第一节概述第二节生物检定质反应直接测定法第四节生物检定法应用第三节生物检定量反应平行线测定法第62页一.量反应平行线关系第三节量反应平行线测定法对于量反应：S和T各自对数剂量和反应应呈直线关系S和T两条直线应平行药品对生物体所引发反应随药品剂量增加产生量变能够测量者，称量反应第63页

∵R=dS/dT；lgR=lgdS-lgdT=XS-XT=M∴R=lg-1M=lg-1（XS-XT）

当供试品按标示量或预计效价进行试验时:

PT=AT·R

或

PT=AT·lg-1M量反应测定方法:惯用(k.k)法，如(2.2法)和（3.3法）。或称4点法（S和T各用2个剂量组）和6点法（S和T各用3个剂量组）。二.测定原理

等反应时(yS=yT):dT·PT=dS·PS

则：

R=PT/PS=dS/dT

令：M=

XS-XT第64页三.量反应平行线法惯用试验设计随机设计随机区组设计交叉设计

第65页四.测定步骤按定型试验设计进行指标测定；将测得反应值(y)按剂量分组列成方阵表;方差计算和可靠性检验（采取定型公式简算法）；进行效价及可信限计算（采取定型公式简算法）。计算软件：中国药典生物检定统计程序

BSForWin-dows9X第66页五.实例-缩宫素效价测定S为缩宫素标准品:

dS1:0.0068udS1:0.009u

T为缩宫素注射液

标示量AT:10u/mldT1:0.008udT2:0.0106ur=1:0.75I=lgr=lg(1/0.75)=0.125

反应(y):子宫收缩高度(mm)(随机区组设计(2.2)法)①试验安排第67页②给药次序

将标准品和供试品高低2个剂量组S1，S2，T1，T2

分别用ABCD表示，作出5组收缩数据（5个区组）。

给药次序：

ABCDBCDACDABDABCCBDA第68页

剂量dS10.0068dS20.0090dT10.0080dT20.0106∑ymy39.568.041.071.0219.537.062.536.053.0188.535.063.037.062.0197.031.558.034.560.0184.030.050.035.060.0175.0173.0301.5183.5306.0964.0∑y(k)S1S2T1T2随机区组设计(2.2)法，K=4，每组4个剂量为一个区组，m=5③将反应值(y)按S和T剂量分组列成方阵表第69页④可靠性检验总差方和,剂间,区组间,