生防菌枯草芽孢杆菌bs2004菌株固体发酵条件的研究

生防菌枯草芽孢杆菌bs2004菌株固体发酵条件的研究

本生代草芽是一种嗜热好氧的杆菌，广泛存在于自然界。它对人类没有伤害，也没有污染环境。它可以产生各种抗菌素和酶，并具有广泛的抗菌活性。该菌能产生耐热抗逆的芽孢,有利于芽孢杆菌在环境中存活、定殖及其生防菌剂的加工、运输。目前,该菌的研究、生产等主要以液体发酵为主,为解决液体发酵产生大量废弃液、造成环境污染和后续应用生产工序复杂等问题,针对具有抗病促生作用的枯草芽孢杆菌Bs2004进行了固体发酵条件及干燥方式筛选研究,为枯草芽孢杆菌固体发酵工艺研究及其应用提供科学依据。1材料和方法1.1土壤分离、种子培养基配方供试菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis2004),于2004年从德国菜园土壤中分离,通过鉴定并引进保存。液体种子培养基配方为:蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl5g、水1L,pH值7.0~7.2。固体发酵培养基所用原料及试剂:麸皮、米糠、玉米粉、豆粕、谷壳、硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母粉、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖等。1.2测试方法1.2.1培养种子取1环活化的保存菌种于盛有20mL液体种子培养基的培养瓶中,混匀,28℃、150r/min培养20h。1.2.2s1004菌株活菌数与od650值间的相关性采用分光光度计法和梯度稀释平板涂抹法结合,测定Bs2004菌株活菌数与OD660值间相关性,建立含菌量—吸光度值曲线。发酵结束,将发酵固形物稀释1000倍,测定OD660值,根据OD值计算活菌数。1.2.3活菌数检测配制麸皮培养基,灭菌接种培养,40h前每隔4h取3个平行样,按1.2.2进行活菌数检测。以时间为横坐标,OD值为纵坐标,建立生长曲线。1.2.4接种od.按不同试验设计因素配比固体发酵培养基,121℃灭菌30min,冷却后接种OD660=0.476,即1×107cfu/mL的种子液1mL,混匀,32℃恒温培养24h。1.2.5基质对活菌数的测定分别以麸皮、米糠、玉米粉、豆粕、谷壳单质和两两等质量混合为基质,称取10g基质,加水使其含水量为60%,浸泡1h、灭菌、接种,每处理3次重复,24h后检测活菌数。1.2.6接种量检测取5g麸皮、5g豆粕,分别按含水量50%、55%、60%、65%、70%、75%比例加水,浸泡1h灭菌、接种,每处理3次重复,24h检测。1.2.7ph值对不同ph值的地层水相互关系的影响分别用1moL/LHCl和1moL/L的NaOH调节水pH值为4~9,0.5为一个梯度,用不同pH值的水,按含水量65%加入5g麸皮与5g豆粕混合基质,浸泡1h后灭菌,每处理3次重复,接种培养24h检测。1.2.8水处理对不同浓度的水的制备取5g麸皮、5g豆粕,加入65%pH值为7.5的水,浸泡1h灭菌,分别置20、24、28、30、32、36、38、40℃培养,每个处理3次重复,24h后检测。1.2.9碳氮源试剂培养取5g麸皮、5g豆粕,加入65%pH值为7.5、分别含有5%的硫酸铵、尿素、蛋白胨、酵母粉、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖等不同的碳、氮源试剂,浸泡1h灭菌,每个处理3次重复,接种培养24h检测。1.2.1真空培养养基、干燥箱、冷冻干燥器的制备用pH值7.5、蔗糖含量5%、酵母粉含量5%的水溶液配置麸皮豆粕培养基,基质含水量65%,浸泡1h后灭菌,接种培养24h取出,置于灭菌滤纸上,分别放于65℃真空干燥箱、80℃恒温烘箱和冷冻干燥器进行干燥处理,每处理3次重复。以发酵结束时的活菌数为参照,干燥完毕检测含菌量。2结果与分析2.1稀释液中活菌数将含菌量与吸光度OD660值作线性回归,得到方程y=1.827x+0.130,其中,x为吸光度值(0.1~0.8),y为稀释液中活菌数(×108cfu/mL)。R2=0.990,表明该标准曲线能准确反映菌株发酵稀释液中活菌数与光密度值的对应关系。2.2固体发酵物含菌量Bs2004菌株在固体发酵物中的生长量与时间关系显著(图1)。该菌在4~16h内生长量增加明显,其OD660从0.024上升到0.337;16~32h,生长量变化趋于平缓,OD660值介于0.337~0.357,培养24h时,含菌量达到最大,OD660值为0.357,即固体发酵物含菌量为7.8×109cfu/g。32h后,生长量急剧下降。由此可见,固体发酵Bs2004菌株,生长延迟期为0~4h,对数生长期为4~16h,16~32h为静止生长期,32h后进入生长衰亡期。2.3最佳发酵基质的确定由表1可知,基质种类对Bs2004菌株固体发酵生长量有显著影响。其中单一麸皮、玉米粉及麸皮与米糠、玉米粉、豆粕组合和玉米粉与豆粕混合作为基质,菌株生长量显著高于其他基质,麸皮与豆粕组合发酵,24h时含菌量最高,其OD值为0.363,即活菌数为7.9×109cfu/g,为最佳发酵基质。单一谷壳、豆粕及其两者组合作为基质时,其发酵物含活菌数极显著低于其他基质,因此不宜用于Bs2004菌株的固体发酵。2.4培养基含水量对细菌总数的影响麸皮、豆粕培养基含水量对Bs2004菌生长的影响见表2。结果显示含水量60%~70%的基质中细菌总数达7.5×109cfu/g以上,极显著高于其他含水量的培养基,而含水为50%、55%、75%的培养基间细菌总数无显著异。说明培养基中水分含量过高和过低都不利于细菌生长。其原因应与水分影响细菌对营养的吸收及培养基质通气性能有关。2.5菌生长力初始pH值显著影响Bs2004菌株的生长(图2),当pH值小于5.5时,Bs2004菌生长力较弱,在pH值6.0~8.0条件下能较好地生长,OD660值介于0.638~0.733,当pH值为7.0、7.5时生长最旺盛,发酵物稀释液OD660分别为0.773、0.774。当pH值大于8.0时,Bs2004菌生长量随pH值增加而急剧下降。2.6固体发酵温度对bs2004菌生长的影响由图3可知,该菌株在20~40℃均能生长。当温度为28~36℃时,发酵物稀释液OD660值大于0.31,即发酵产物含菌量超过6.9×109cfu/g,显著高于其他温度发酵物含菌量,其中当温度为32℃时,Bs2004菌生长量最多,OD660值为0.361,说明32℃为该菌最适宜的固体发酵温度。2.7bs2004菌的生长碳氮源差异对枯草芽孢杆菌Bs2004菌株固体发酵生长量的影响显著(图4)。蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钾、牛肉膏和酵母粉作为发酵氮源时,硝酸钾最不利于Bs2004菌的生长,发酵结束,稀释液OD660值仅为0.012,以酵母粉作为氮源时OD660值为0.649,说明酵母粉为最适宜的Bs2004菌生长氮源。以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等8种糖为碳源时,乳糖、阿拉伯糖对应的发酵物稀释液OD660值显著低于其他糖类,蔗糖作为碳源时,OD660值为0.370,为最优碳源。图4显示酵母粉为氮源,无碳源时,活菌数达1.31×1010cfu/g,蔗糖为碳源,无氮源时,活菌数为8.06×109cfu/g,由此看出,氮源对Bs2004菌株的生长具有显著的促进作用。2.8发酵物含菌量的变化经发酵条件的筛选确定,各最优因素组合发酵,得到发酵产物含菌量为9.62×109cfu/g。从表3可以看出,干燥方式显著影响Bs2004菌固体发酵产品中的含菌量。发酵物经冷冻干燥和65℃真空干燥后,发酵物活菌数与干燥前差异不显著,显著高于80℃恒温常压干燥。真空干燥后含菌量为9.581×109cfu/g,优于冷冻干燥,但两者差异不显著,说明Bs2004菌对低温耐受力较强,对高温的耐受力较差,遇高温细胞极易死亡,因此Bs2004菌株固体发酵物通过65℃真空干燥和冷冻干燥是可行的。3发酵条件及培养效果在生防枯草芽孢杆菌Bs2004菌株固体发酵过程中,发酵基质种类、含水量、pH值、培养温度、碳氮源种类以及干燥方式都直接影响发酵产物或发酵产品中活菌量。通过试验确定,麸皮或麸皮与豆粕等质量的比例混合都是较好的发酵基质,发酵基质含水量为65%,pH值7.5,以酵母粉为氮源,蔗糖为碳源,32℃培养24h为较优发酵条件,发酵产物含菌量为9.62×109cfu/g。发酵物经65℃真空干燥含菌量为9.581×109cfu/g,推荐为最佳干燥方式。