小麦反义mlo基因在小麦愈伤组织中的遗传转化与鉴定

小麦反义mlo基因在小麦愈伤组织中的遗传转化与鉴定

明末清初是由粉菌（bgt）引起的一种高度专业化的真菌疾病。白粉菌生理小种多,变异速度快,抗病品种往往因为生理小种变异而感病,这就大大地缩短了品种的使用年限。利用基因工程方法选育广谱抗白粉病品种将是比较经济和有效的方法之一。野生型Mlo基因是大麦(Hordeumvulgare)抗白粉病的负调控因子,隐性突变的mlo基因介导了大麦对白粉菌(B.graminisf.sp.hordei,Bgh)的广谱抗性。Shirasu等和Kim等将完整的Mlo基因转到mlo突变的大麦中,瞬间表达后,mlo突变的大麦对白粉病菌的感病性得以恢复。Schweizer等利用基因枪将Mlo-dsRNA直接导入Mlo背景的大麦品种叶片,导入Mlo-dsRNA基因的叶表皮单细胞高抗白粉病菌侵入。随后Buschges等和Devoto等也证明大麦Mlo基因是一种植物防卫机制的负向调控因子。研究表明,大麦mlo基因不会引起被侵染细胞的过敏性坏死反应,而是利用乳突抗性(又称为细胞壁加厚)机制来抵抗病原菌的侵入,mlo基因促使乳突高频、快速形成和保持时间长是大麦抗白粉菌侵入的关键。因此Mlo抗性代表了一类由寄主基因突变控制的植物广谱抗病新机制。全面深入地研究Mlo基因及其介导的抗病性对揭示植物广谱抗病机制、创造优良的抗白粉病新抗源具有重要意义。小麦是大麦的近缘种,而且二者的Mlo基因具有高度的同源性,推测它们可能具有相似的作用机制。Wang和Waterhouse提出可以通过RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)或者反义技术(antisense)关闭或者减弱植物自身Mlo基因的表达以赋予植物抗病性。赵同金等将大麦Mlo反义基因通过农杆菌介导的苗端转化法转入小麦中,获得了抗白粉病的转基因植株,但并未验证小麦内源Mlo基因沉默的效率以及探究抗性产生的分子细胞学机制。本实验室于玲等克隆了一个小麦Mlo基因(Ta-Mlo),其cDNA全长序列为1602bp(GenBank登录号为AF384144),其氨基酸序列与大麦Mlo基因(GenBank登录号为gi7489389)编码蛋白的相似性为89%。为进一步了解该小麦Mlo基因的功能及其与小麦白粉病抗性的关系,本实验构建了包含该Ta-Mlo反义基因的植物表达载体,利用基因枪法将其导入高感白粉病的小麦品种中,期望通过转录后基因沉默(PTGS)途径造成小麦内源Mlo基因表达缺失,验证转基因植株基因沉默的效率并鉴定其白粉病抗性,从而进一步探讨该小麦Mlo基因的作用机制。1材料和方法1.1小麦种子的诱导采用综合农艺性状优良的感白粉病小麦品种扬麦158和济麦20作为转化受体。选取开花后12~16d的小麦未成熟种子用于幼胚愈伤组织的诱导。依照蒋正宁等的方法消毒种子及诱导培养愈伤组织。1.2表达载体的构建将Ta-Mlo编码序列从pGEM-T-easy载体上用NotI切下,并连接到中间载体pBluescript的相同酶切位点处,将重组克隆用pBluescript载体上M13左引物(M13F)和目标基因左引物(MloF)进行PCR扩增,筛选出目标基因反向插入的克隆pBS-Mlo(–),再以SmaI和SacI从pBS-Mlo(–)切下目标基因,在相同酶切位点处替换表达载体pAHC25载体上的GUS基因编码序列,由此将目标基因克隆到强启动子ubi的下游,获得表达载体pAHC-Mlo(–)(图1)。1.3杂草抗性芽苗的恢复培养以预培养7~10d的幼胚愈伤组织为转化受体,在轰击前6h至轰击后16h进行高渗处理。基因枪轰击方法和轰击参数参照王华忠等的方法。轰击后的愈伤组织转移到无选择压的SD2培养基上恢复培养2周,并使选择标记基因充分表达。恢复培养后转移到添加3mgL-1除草剂Bialaphos的筛选培养基进行除草剂抗性芽苗的分化,每3周继代一次,于26℃、光照10hd-1和光照强度为40μmolm-2s-1条件下培养,经两轮筛选及分化,当除草剂抗性绿芽长至3~5cm时,转入生根壮苗培养基中。待苗长到6~8cm高时,开管炼苗2~3d,用清水洗净苗根系上的培养基后移栽至瓦盆,在温室生长成株。1.4对转植的分子检测1.4.1dnapcr扩增依据BAR基因和目标基因序列设计3对扩增引物,分别是BARF:5′-CGAGACAAGCACGGTCAACTTC-3′,BARR:5′-AAACCCACGTCATGCCAGTTC-3′,退火温度63℃,扩增片段长度402bp;MloF:5′-ATGGCAAAGGACGACGGGTA-3′,MloR:5′-AAGCGGAACCGCGCAGGATC-3′,退火温度60℃,扩增片段长度为548bp;UbiF:5′-CCACATCATCACAACCAAGC-3′,UbiR:5′-ACCCAGATCTCCCCCAAATC-3′,退火温度55℃,扩增片段长度616bp。小量提取T0和T1代转化植株及受体对照的基因组DNA,分别使用上述引物对进行PCR筛选和鉴定。PCR反应程序为94℃预变性,3min;94℃变性,30s,退火45s,72℃延伸1min,35个循环;72℃再延伸10min;10℃保存。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后,用凝胶成像系统拍照和分析。1.4.2实时荧光定量pcr检测PCR-Southern杂交取上述目标基因PCR扩增产物,纯化后经0.7%琼脂糖胶电泳,采用碱法转移到AmershamHybondN+膜上。斑点杂交采用转基因植株的基因组DNA(以受体品种作对照)经超声波破碎及碱变性后,直接点到AmershamHybondN+膜上。探针均采用地高辛标记的用特异引物扩增获得的目标基因片段(548bp)。探针标记和Southernblot均采用DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII试剂盒(Roche),按使用说明书操作。1.4.3实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR,qPCR)检测提取T0代经分子检测为阳性的18个单株的总RNA,其中表现高抗(病级为0;和1)的6株,以扬麦158和济麦20为受体各3株;表现中抗及中感(病级为2~3)的8株,包括以扬麦158为受体的5个单株和以济麦20为受体的3个单株;表现高感(病级为4)的4株,两基因型受体各2株。以未转基因受体为对照。利用PrimeScriptRTreagentKit(TaKaRa)反转录成cDNA,用PremixExTaq(ProbeqPCR)Kit(TaKaRa)进行PCR扩增。1.5保护患者两组小鼠血清中bata的抗性差异T1代小麦植株长至4~5叶时,在新叶近端部涂抹浓度为120mgL-1的BASTA水溶液(中国农业科学院徐惠君研究员惠赠),10d后观察抗性差异并拍照记录。1.6苗期接种张量成像将T0代和T1代转化植株种植于南京农业大学江浦试验站塑膜大棚中,苗期人工接种白粉病混合菌种,接种7d后调查并记录发病情况,按盛宝钦提出的苗期反应型(0~4级)分级标准进行抗病性鉴定,0、0;和1级为高抗,2级为中抗,3级为中感,4级为高感。1.7水合氯醛法白粉菌接种后12、18、24、30、36和48h,分别对转基因植株和受体对照植株的叶片取样,将叶片样品在含0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中于37℃恒温箱脱色48h,中间更换2~3次脱色液,直至叶段完全透明,保存于水合氯醛溶液中,显微镜观察前用考马斯亮蓝染色液(0.15%三氯乙酸水溶液:0.6%考马斯亮蓝R-250甲醇溶液=1∶1,V/V)染色10min,再用蒸馏水漂洗,滴加甘油∶水(1∶1,V/V)溶液镜检。使用Leica光学显微镜观察染色后的叶片,统计分析100~150个白粉菌侵入位点的乳突和吸器的形成情况,用SAS9.1.3进行Duncan氏新复极差检验法分析观测数据。2结果与分析2.1再生小麦基因组外源基因嵌入及pcr扩增检测采用基因枪法将Ta-Mlo反义基因导入高感白粉病的扬麦158和济麦20幼胚愈伤组织,轰击幼胚愈伤组织各约2000块,经筛选、分化和生根壮苗培养(图2-A~C),获得以扬麦158为受体的具除草剂抗性的再生植株154株,再生频率为7.2%;以济麦20为受体的具除草剂抗性的再生植株102株,再生频率为5.1%。为了检测再生小麦基因组中是否有外源基因的插入,首先用BAR基因引物对T0代转化植株的gDNA进行PCR扩增检测,在256个T0代植株中,有69个单株(以扬麦158为受体36株,以济麦20为受体的33株)扩增出预期的402bp片段,而受体对照植株未出现该片段(图3-A)。为避免小麦内源Mlo基因的干扰,以ubi启动子左引物UbiF和目的基因Ta-Mlo左引物MloF搭配进行PCR扩增检测,在上述69个单株中有63个单株(以扬麦158为受体33株,以济麦20为受体的30株)同时也能扩增出与质粒对照相同大小的DNA片段(2218bp),而受体对照无扩增带(图3-B)。3次重复结果一致,初步确定这63株T0代转化植株为PCR阳性转化植株,因此以扬麦158为受体的转基因频率为1.7%,以济麦20为受体转的基因频率为1.5%。2.2对转植的分子检测2.2.1r-硫化学和基因组dna的杂交为进一步明确转基因植株的真实性,对T0代PCR阳性植株进行PCR-Southern杂交和基因组DNA点杂交验证。结果显示PCR阳性植株都可检测到与质粒对照相同大小的杂交带(图4-A)或杂交点(图4-B),仍表现为阳性,而阴性对照没有出现任何杂交信号。2.2.2不同基因植株的ta-mlo基因表达差异对18个分子检测为阳性且不同病级的T0代转基因植株和2个受体对照植株内源Mlo的qPCR分析结果表明,与受体对照相比,绝大多数转基因植株的Ta-Mlo基因表达量显著降低(图5),说明反义基因的导入能有效地沉默其内源Mlo基因,但不同转基因植株降低的程度并不一致。高感植株的Ta-Mlo基因的表达量都比较高并接近感病受体品种,但表现中抗和中感的转基因植株的抗性水平和Ta-Mlo基因的表达量并不完全对应,说明转基因植株表现出的抗病性可能还受体内复杂的分子机制调控。2.3对基因突变植株抗感病的鉴定PCR检测呈阳性的T1代转基因植株经BASTA水溶液处理10d后,叶片上涂抹BASTA的部位虽有些脱水但仍然透绿,而对照叶片上涂抹BASTA的部位明显变黄枯死(图6)。这与分子检测的结果相一致,说明BAR基因也导入到受体小麦中并且可遗传到T1代。接种白粉菌7d后,非转基因对照充分发病,病级为4级,表现为高感;以扬麦158为受体的33株T0代转基因植株中有1株表现近免疫(0;级),2株表现高抗(1级),17株表现中抗到中感(2级和3级);以济麦20为受体的的30株T0代转基因植株中有3株表现高抗,3株表现中感(表1)。由此可见,反义Ta-Mlo基因的导入在某些情况下能够使转基因植株的白粉病抗性提高。将经过白粉病抗性鉴定且T0代分子检测为阳性的18个转基因单株的种子播种获得T1代植株,苗期剪叶片提取DNA进行目标基因的PCR鉴定后,阳性植株和受体对照同时接种小麦白粉病混合菌进行抗性分级鉴定。结果表明,T1代不同株系中对白粉病的抗性发生了分离,T0代为抗病单株的后代多数仍表现抗病,T0代为感病单株的后代则仍表现感病(表2)。说明由反义基因导入造成的Mlo基因沉默能够有效地遗传给下一代。2.5感病材料的e在接种白粉菌12h后,不同受体背景的抗病转基因材料(简称抗病材料)和感病受体材料(简称感病材料)叶片的表皮细胞内,白粉菌侵入点下方均可观察到明显的乳突反应(图7-a,b),抗、感材料的乳突在产生初期差异不明显,说明小麦在白粉菌侵入早期均有一定程度的乳突反应。随着侵染时间的延长,抗、感材料中形成乳突的孢子百分率都逐渐增加,于接种后24h达到峰值,但感病受体材料不如抗病转基因材料增加显著,说明抗病转基因材料乳突的形成速度较快。此后感病材料中观察到乳突形成的孢子所占百分率逐渐降低,抗病材料中也逐渐降低,但降低的趋势较缓慢,在接种后30、36和48h时抗、感之间呈现出显著差异(图8-A),说明抗病材料中乳突维持的时间较长,抑制或延缓了白粉菌的进一步发育。经考马斯亮蓝染色,不同受体背景的抗、感材料在接种白粉菌12h后,有孢子侵入的叶片表皮细胞内可以观察到少量的吸器形成,随着接种时间推移,感病材料中吸器数目迅速增加,抗病材料的吸器数目也逐渐增加,但增加的速度相对较缓慢。接种后24h,以扬麦158和济麦20为受体的抗病转基因材料的吸器形成百分率分别达峰值22%和19%,随后逐渐下降,在接种后48h降至7%~8%,而2个感病受体对照的吸器形成百分率在接种24h后维持在50%~65%左右(图8-B)。同时,可以观察到吸器形态在抗、感材料间也有显著的差异,感病材料在接种后24h开始出现大量正常的指状吸器(图7-c),而抗病转基因材料的白粉菌侵入的细胞内观察到吸器数目较少,且吸器的形态偏小或畸形(图7-d)。说明由于转基因材料的抗性作用使吸器的发育受阻,白粉菌孢子无法吸收寄主营养而进一步发育,从而转基因材料表现为抗病。3mlo基因对小麦抗性的影响大麦Mlo基因的隐性突变(mlo)可以使大麦获得对几乎所有已知大麦白粉病菌生理小种的广谱、高效和持久抗病性。Wolter等认为Mlo基因缺失或移码突变成为mlo后,不能合成有正常功能的MLO蛋白,因此对细胞死亡的负调控作用被解除,同时可引起细胞壁加厚,有助于防止白粉病菌的侵染,由此引发广谱抗病性。Uwe等研究表明MLO蛋白通过抑制抗真菌基因(avrMla)的防御反应,抑制由病原物相关分子表型(PAMP)引发的基础抗性(PTI),导致感病性。进而Panstruga提出了大麦Mlo与白粉病菌的互作模型,白粉菌萌发的芽管附着在表皮细胞上后,PAMPs引发信号传导,激发大麦获得性免疫系统,从而导致了一系列的生化免疫反应,促进白粉菌的生长。Mlo基因与白粉病菌互作的分子机制研究表明,mlo抗性的完全表达需要Ror1、Ror2基因的参与;一种小G-RACB蛋白与大麦mol抗性密切相关,能够调节MLO对白粉病菌的感病性;据报道,MLO蛋白还是一种钙调素结合蛋白,对抗性基因的负调控作用会被病原菌侵入激活,可能参与植物抗病性反应的细胞信号传导。从盐胁迫的小麦幼茎和根部分离出7个组织特异性表达的小麦MLO蛋白家族成员,并通过比对水稻等模式生物的同源序列进行了系统进化研究;劭伯飞克隆的TaMlo3基因(AF336105)在抗病品种中的表达丰度持续非常低,而在感病品种中表达丰度高,且表达量在白粉菌接种后6h达到最低后逐渐恢复正常,说明TaMlo3的表达量与抗性抑制程度有关;徐红明等和孙燕飞等的研究也显示,Mlo基因在小麦与白粉菌亲和互作中的表达高峰远远高于与非亲和组合。Eva等采用大麦条花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默(VIGS)的方法抑制感病小麦中TaMlo基因(GenBank登录号为AF361933)的表达,接种白粉菌后发现Mlo基因沉默的植株的抗病性增加,微观表现为次级菌丝和菌落的形成率较对照显著降低,说明小麦内源Mlo基因的沉默可提高感病小麦的白粉病抗性,但未在稳定转化情况下验证。赵同金等和吴莹莹分别对大麦Mlo基因和小麦Mlo基因的反义序列进行转化小麦研究,获得了抗白粉病小麦转基因植株,但未对小麦内源Mlo基因沉默的效率进行检测,亦未对转反义Mlo基因小麦的白粉病菌侵入进行细胞学观察。本实验室于玲等克隆了小麦Ta-Mlo基因