解脲支原体活性机制的研究

解脲支原体活性机制的研究

近年来，由于使用抗生素的广泛使用和不适当的剂量，如交沙霉素、二羟色胺、丙烯酸酯、吉帕霉素、氯霉素、血红蛋白、氯霉素等，临床分离服药支架（uu14）的数量正在增加，服药菌的继续发展和反复感染，这给控制ngv带来了困难，现在是治疗内脏器官僚主义者的难题。中西药联合用药将是临床用药的一种趋势。为此,筛选出对Uu14敏感性较强的复方制剂,旨在探讨中药有效成分对Uu14的抑制效果,并期待下一步揭示出其活性机制的研究状况。1数据和方法1.1解哌受体培养基①中药:苦参、白花蛇舌草、黄芩(吉林省药材公司)100%浓度水煎剂,相当于每毫升含2克生药。黄芩甙(baicalin中国药品生物制品检定所)以吐温-80配制成30mg/ml原液备用。②解脲支原体标准株:Uu14血清型解脲支原体标准株由首都儿科研究所细菌室提供。③解脲支原体培养基:PPLObroth2.10g,25%新鲜酵母浸液10ml,20%标准胎牛血清(56℃灭活,去除支原体),0.002%酚红,0.2%尿素。pH值调至6.0。若制备半固体解脲支原体培养基,则加入0.7%琼脂粉,高压灭菌后备用。酵母浸液、胎牛血清、尿素过滤除菌后加入培养基中。1.2实验方法1.2.12支架的生长和颜色变化单位按照RobersonJA,1987年文献方法。1.2.2中药复方制剂的mic测定按照KennyGE,1986年文献方法略加改进。1.2.3药物稀释度的测定将Uu14血清型解脲支原体标准株连续传代三次,取第三代对数生长期培养物(1×106CCU/ml),以PPLO肉汤稀释至8×104CCU/ml备用。方法一,液体培养基稀释法:在96孔细胞培养板上,第1孔加入PPLO肉汤培养基150μl,第12孔加入200μl,第3~11孔加入50μl。其次,向第2、3孔中加入中药复方制剂50μl。然后,从第3孔开始倍比稀释复方药物至第11孔。用微量移液器在各孔中吹打药液10次后,将其混匀吸至下一孔,直至第11孔。对照药物单体黄芩甙的稀释方法同样进行。第11孔稀释完毕,从中吸出50μl丢弃。最后以PPLO肉汤补足2~11孔内的培养基量,每孔100μl。由此,黄芩甙在第2~11孔中,10个稀释度的药物浓度分别是30mg/ml……0.058mg/ml;复方药物水煎剂2~11孔的稀释浓度为500mg/ml……0.48mg/ml。分别向第1~11孔加入50μl的8×104CCU/ml解脲支原体培养物。至此,所有孔中的液体体积均为200μl(Uu14数量为2×104CCU/ml)。第1孔为Uu14阳性对照孔,第12孔为阴性对照孔。加样完毕后盖上板盖,充分震荡后置于湿盒内,37℃恒温培养箱内孵育24h后观察结果。在第1孔(阳性对照)培养基发生颜色改变后,便可根据实验结果确定药物的最小抑制浓度。以最高稀释倍数,无颜色变化孔的药物浓度为最小抑制浓度,即MIC值。方法二,半固体琼脂对倍稀释法:制备含有不同稀释度药物的培养基平板,每种药物首先以PPLO肉汤制备出10个稀释度的药液。黄芩甙10个稀释度药液浓度分别为60mg/ml……0.11mg/ml,复方药物水煎剂10个稀释度药液浓度为500mg/ml……0.97mg/ml。其次,于直径7.5cm玻璃无菌平皿中加入不同稀释度的药液0.75ml,每个稀释度药液设置3个重复培养平皿。然后注入已经融化冷却至45℃的半固体琼脂培养基7.5ml,立即旋转混匀,待凝固后每板药物培养基接种100μl的1×103CCU/ml解脲支原体培养物(1×106CCU/ml,稀释1000倍),划线涂布于整个培养基表面。翻转平板后,置37℃5%二氧化碳培养箱内孵育48h,取出后在低倍显微镜下观察解脲支原体生长的情况。以未见到Uu14生长的药物稀释度为最低抑制浓度,即MIC值。2液体培养稀释法与倍稀释法mic检测结果比较体外实验结果显示,中药复方制剂对解脲支原体(Uu14)有抑制作用,MIC检测结果其敏感程度为中度敏感。比较两种实验方法,液体培养稀释法的MIC值高出半固体琼脂对倍稀释法MIC值2个稀释度。结果见附表。3影响解哌抗体感染的因素解脲支原体是性传播疾病的重要病原体之一,它可侵犯女性尿道、宫颈及前庭大腺,引起尿道炎、宫颈炎与前庭大腺炎;上行感染时,可引起子宫内膜炎、盆腔炎、输卵管炎,尤其以输卵管炎多见。由于女性生殖器官受解脲支原体的感染,从而导致孕妇流产、死胎、早产、不孕及胎儿宫内发育迟缓。有资料提示,不孕症夫妇的宫颈粘液、精液中解脲支原体培养阳性率高达50%以上,解脲支原体感染与不孕症的发生有相关关系。解脲支原体感染造成不良的另一个原因是流产,有人从流产的组织中检出解脲支原体的阳性率高达40%以上。因此,对不明原因的流产,尤其是多次流产者,应考虑有解脲支原体感染的可能。解脲支原体感染造成的不完全梗阻的输卵管炎性粘连,可使管腔狭窄,通而不畅,还是发生宫外孕的重要原因。按照KennyGE的实验方法,测定了中药复方制剂对Uu14的MIC值,并与单体黄芩甙进行对比观察。结果表明,复方药物对Uu14的敏感性为中度敏感,MIC在3.75~7.81mg/ml范围之间。即在MIC<7.81mg/ml时,培养基中有Uu14生长;MIC>3.75mg/ml时,培养基中则没有Uu14生长。液体培养基稀释法的MIC值要比半固体琼脂对倍稀释法高出2个稀释浓度的数值,原因是琼脂载体等物质有限制药液扩散的作用。尽管两种实验方法出现2个MIC值,但是排除掉干扰因素,中药复方制剂MIC值还是能够确定的。与黄芩甙对比观察,黄芩甙对Uu14的敏感程度较高。能否可以这样说,中药复方制剂对Uu14的抑制作用,主要是通过其中黄芩抑制Uu14的DNA复制过程,破坏掉某一程序完成的。但其复方制剂中几味中