原生质体融合与体细胞杂交（植物组织培养课件）

原生质体培养与体细胞杂交

植物组织培养技术教学终极目标

掌握原生质体培养1.了解原生质体培养和体细胞杂交的意义2.掌握原生质体培养和体细胞杂交的基本过程和主要方法促成目标教学目标工作任务原生质体的培养及活力鉴定任务3对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离任务1原生质体融合及融合体的培养

任务4融合体的选择及杂种细胞进行鉴定

任务5

对获得的原生质体纯化任务2微丝叶绿体线粒体质膜细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图液泡项目介绍原生质体含义：

去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。它在培养条件下①具有再生细胞壁，进行连续的细胞分裂并再生成完整植株的能力；②具有摄取外源大分子、细胞器，以及细菌，病毒的能力，因此是进行遗传操作，基因转移的好材料；③通过同种和异种植物的原生质体融合，可产生异核体，实现体细胞杂交，培育出新品种。原生质体培养的意义

植物原生质体培养和细胞融合是植物细胞工程的核心技术，尤其在克服远缘杂交不亲和性、创造种质资源方面发挥了重要作用；

植物原生质体比较容易摄取外来遗传物质，是遗传转化的理想受体，为细胞水平、分子水平上的遗传操作提供了理想的实验体系；为细胞生物学、植物生理学和体细胞遗传学的发展做出了重要贡献。原生质体培养与体细胞杂交

——原生质分离培养

植物组织培养技术工作任务原生质体的培养及活力鉴定任务3对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离任务1原生质体融合及融合体的培养

任务4融合体的选择及杂种细胞进行鉴定

任务5

对获得的原生质体纯化任务2原生质体存活率测定原生质体纯化原生质体培养原生质体融合融合体培养原生质体分离融合体的选择杂种细胞鉴定原生质体培养和体细胞杂交基本流程及常用方法实践知识一、向日葵下胚轴和子叶的原生质体分离（酶解法）

（一）无菌苗培育

选取仔粒饱满日葵种子去壳后,消毒将消毒的种子接种于不含任何激素的MS固体培养基上。置于暗处发芽,温度为(26±1)℃。（二）酶液的配制

酶液Ⅰ组成：纤维素酶酶液Ⅱ组成：纤维素酶（三）原生质体分离(一步分离法)

取前面培育的无菌苗，用刀片切下下胚轴后撕去表皮，纵剖若干细条，再横切成2～3mm小段放入酶液Ⅰ中。撕去叶片的小表皮，切成小块放入酶液Ⅱ中。每10mL酶液中约放2g材料，在26℃下酶解3～4h，其间摇动几次。

（四）向日葵下胚轴原生质体的纯化（漂浮法）漂浮法：是指应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面，来进行原生质体纯化的方法。

向日葵下胚轴原生质体的纯化具体方法步骤如下：

1.将酶解后的向日葵下胚轴原生质体用200目不绣钢网过滤，除去未解离的组织，再用22%的蔗糖溶液冲洗网上残渣（蔗糖溶液体积与酶液相等）。

2.滤液（即酶液和蔗糖液）装入离心管，以600r/min离心3～6min。

3.待原生质体漂浮后吸去下面的液体及残渣。4.加入17%蔗糖溶液6～8ml，混匀后离心（600r/min，5分钟），吸去下面的液体及残渣，重复一次。5.加入1～2ml0.16mol/LCaCl2•2H2O（加1%MES，pH=5.8），使原生质体的密度在2103g/ml条件下悬浮，以备后面进行原生质体培养和融合之用。

（五）向日葵子叶原生质体的纯化（界面法）界面法：是指选用两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液密度小于原生质体的密度，原生质体即介于两种溶液之间，从而对原生质体进行纯化的方法。

原生质体分离及纯化

一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞（一）材料来源多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。问题探究

禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞。供体材料的重要性

供体材料是影响原生质体培养能否成功的关键。理论上植物的各种器官、组织和细胞都可作为分离原生质体的供体材料，但目前常用叶片、分裂旺盛和再生能力强的愈伤组织及悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系是最理想的原生质体分离材料。（二）分离方法机械分离法酶法分离法最初用的是机械分离的办法，但是效率极低。英国科学家Cocking于1960年利用酶.降解去细胞壁的办法从番茄根尖分离了大量的原生质体，成为现在广泛使用的方法。首先对外植体进行预处理有两种方法：低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。1、机械分离法优点：

（1）能排除酶的有害影响；

缺点：

（1）原生质体的产量低；

（2）方法繁琐费力；

（3）液泡化程度低的细胞也不能采用,此方法局限性大步骤：使细胞质壁分离→切开细胞壁→获得原生质体。（1）确定酶的种类纤维素酶类（Cellulase）果胶酶类（Pectolyase）半纤维素酶类（Hemicellulase）崩溃酶蜗牛酶2、酶法分离（Enzymaticisolation）

植物细胞膜和细胞壁的构成：细胞膜：脂类、蛋白质细胞壁：初生壁（纤维素、半纤维素、果胶、量结构蛋白）、次生壁（纤维素、半纤维素）两个相邻细胞的初生壁之间有胞间层。（2）酶液的配制酶的配比及浓度渗透压稳定剂及pH（3）分离原生质体一步法：外植体放入酶液，真空泵抽引渗透处理、26℃摇床振荡2-8小时方法有二：

叶肉原生质体分离提纯两步分离法一步分离法两步法：果胶酶处理材料、游离出单细胞、纤维素酶处理单细胞、分离出原生质体优点：所获得的原生质体均匀一致、质量好；缺点：操作复杂，已被淘汰。图示一步法原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化方法三种离心沉淀法漂浮法界面法

纯化原因：上述酶处理后的混合物含有：未消化组织、破碎细胞和原生质体。所以，必须对得到的混合液体进行纯化，以得到纯净的原生质体。问题探究1、离心沉淀法

原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤，除去未消化的组织细胞。第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。沉降法的优点：纯化收集方便，原生质体丢失少；目前被广泛采用。缺点：原生质体纯度不高。2、漂浮法原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。步骤：第一步：400目网筛过滤。第二步：离心。第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。漂浮法的优点：原生质体纯度高。缺点：原生质体收率低。3、界面法(不连续梯度法)

原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液

步骤离心管中配制成不同的浓度梯度加入原生质体混合液离心5min，原生质体位于某一浓度梯度，用吸管收集液体培养基。悬浮洗涤原生质体2-3次将原生质体悬浮在液体培养基中备用优点：获得的原生质体大小均匀一致，纯度高；

缺点：操作繁琐，原生质体收率低。（二）原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。2、染色识别

1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。

2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。影响原生质体培养的因素原生质体活力原生质体起始密度：过低过高均不利渗透压稳定剂：常用甘露醇培养基成分培养条件：初期培养是暗培养植物种类

原生质体培养一、培养基pH渗透压钙镁生长物质氮源碳源培养基

（1）碳源

葡糖糖是最佳碳源，蔗糖单独使用效果较差，与葡萄糖配合使用效果较好。碳源的作用一是保持细胞渗透压，另一方面是作为细胞分裂时的能源物质和组成原料。（2）氮源

适当浓度的谷氨酰胺有利于原生质体的的细胞再生、分裂、生长。NH4+浓度太高不利于原生质体的培养，有毒害作用，在马铃薯上已有研究证明。（3）生长物质

生长素和细胞分裂素是细胞分裂分化所需要的通常物质，原生质体培养也需要这些生长调剂。但不同植物对生长调节剂的浓度要求不同。（4）钙镁

研究指出在原生质体培养中增加Ca2+的浓度。可增强原生质体的稳定性，提高原生质体的分裂能力率。明显改变细胞内外的离子交换。（5）渗透压

最常用的渗透调节剂是山梨醇和甘露醇，两者常结合在一起配合使用。现在很多人用葡萄糖代替糖醇。（6）pH及灭菌

一般pH为5.6-6.0之间，培养基偏酸不利于与原生质体的培养。（7）常用培养基：MS、B5、N6.2、养条件培养温度25-27度，光照16h/d左右，静置为主，但为了不使细胞集聚，最初几天需要经常轻轻摇动，以助通气。有些材料不需要光照，所以依材料而定培养条件。3、与同种材料的不同基因型二、培养方法培养方法液体浅层培养平板培养法双层培养法饲养层培养法原生质体悬浮液1mm厚液体培养基2x105/ml1、液体浅层培养2、平板培养

原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37

C左右）等体积混合成0.7%，培养于培养皿中。3、双层培养法（固、液培养）

培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。固体培养基4、饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。4、饲养层培养1、细胞壁再生：原生质体培养后1-2天即可合成完整细胞壁，只有形成完整细胞壁的细胞才能进入细胞分裂。2、细胞分裂、愈伤组织或胚状体形成3、植株再生途径：（1）通过愈伤组织形成不定芽；该途径占多数。（2）原生质体再生细胞直接形成胚状体。植株再生问题探究第一次分裂第二次分裂第三次分裂多细胞团原生质体的分裂肉眼可见细胞团愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株植株再生途径烟草原生质体培养实验过程示意图A把作了表面消毒的烟草叶片的下表皮撕掉，露出叶肉组织；b切取小块叶肉组织，漂浮在纤维素酶和果胶酶等混合液，缓缓振动使游离出原生质体；c通过密度梯度离心收集原生质体；d分别作微滴培养，饲养培养和液体培养；e愈伤组织培养和继代培养；f再生植株原生质体培养与体细胞杂交

——原生质体融合方法

植物组织培养技术定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。原生质体融合体细胞杂交：通过物理或化学的方法使原生质体融合，通过培养获得具有双亲遗传物质的后代。也叫做原生质体融合。问题探究一、原生质体融合意义—克服杂交不亲合—克服生殖器官败育—克服柑桔多胚对照果实处理果实对照种子处理种子

１９６０年英国生物学家科金发明了用酶脱除细胞壁的方法，给植物细胞融合技术扫清了第一道障碍。在许多研究人员成功地进行了不同植物的细胞融合，并培养出了再生植株后，许多人开始尝试培育不同种属的超级杂交植物。１９７８年，德国的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交后代———薯番茄。

先用酶液除去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两种去壁细胞（原生质体）等量混合，在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原生质体紧密粘聚，再用高钙和高ｐＨ溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种原生质体的融合率竟高达４０％～５０％。他们也曾进行过有性杂交的实验，但都失败了。

01ｅ26超级杂交水稻

通过籼粳亚种间杂交，获得超级优质杂交晚稻01ｅ26，该品种具有产量高、抗性强、米质优等特点.2003年开始在宁海、温岭、温州、福建4个不同纬度的基地试种，其中温岭测产每亩突破750公斤。

01e26超级杂交晚稻番茄+马铃薯

1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出马铃薯的块茎。后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”，据说番茄的产量很高。二、植物体细胞杂交的主要程序：原生质体的制备原生质体融合杂种细胞的选择杂种细胞的培养杂种植株的鉴定融合过程

产生的融合子中可能有杂合双倍体和单倍重组体不同的类型三、融合方法1、自发融合自发融合是在酶解细胞壁过程中，由于细胞间连丝的扩展和黏连，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体，每个同核体包含2－40个核。

无机盐诱导融合高pH-高Ca离子聚乙二醇(PEG)法

PEG结合高钙-高pH诱导法电融合技术2、诱发融合

由于质膜表面带负电性，原生质体间互相排斥，所以要采用一定的诱导方法，能促进原生质体的融合。不同来源的原生质体融合形成的杂种原生质体叫做异核体。(一)无机盐诱导融合:NaNO3法

1972年：Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起不足：诱导频率不高。1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃时，诱发烟草叶肉原生质体融合。优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用。（二）高pH-高Ca离子法（聚乙二醇）（三）PEG法PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。PEG：略带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥的作用，可使原生质体凝聚。PEG法示意图-+-桥梁+-PEG被洗掉+-+-电荷重排+-+-+-+-膜接触PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物植物+动物动物+酵母PEG处理特点：有异核体形成频率高、重复性高、对细胞的毒性低、融合诱导无特异性。最为常用。具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞（四）PEG结合高钙-高pH诱导法Ca2＋：可以在蛋白质（或磷脂）与PEG的负极性基团间形成桥，因而可促进粘连。(五)电融合技术电融合仪

在现代生物学研究中，细胞电融合是单克隆抗体制备、哺乳动物克隆以及抗肿瘤疫苗制备等最新方法中的一个基本步骤。与通过聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合的化学方法相比，细胞电融合是一种更高效的方法。

Zimmermann教授于1978年创立了细胞电融合的方法。从那以后，他一直致力于进一步发展该技术。Senda1979年首先用此方法实现原生质体融合1.电融合法原理

交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。+-负极正极+-+-+-+-+-+-+-+-

施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。+-+-+-+-+-+-+-+-细胞融合仪

细胞先在交流电场中聚集，然后通过直流脉冲融合。特定的缓冲液体系可帮助完成高效的细胞电融合。A．聚集通过双向电泳，细胞互相紧密接触。B．融合脉冲采用仅仅15微秒的方波脉冲穿透细胞膜，细胞膜随后发生融合。C．异核体期细胞膜完全融合，细胞质也完全混合。只有细胞核仍然保持分离状态D．完全融合产物现在细胞核也发生了融合。根据常识，染色体数量下降。ABCD2.电融合的过程燕麦原生质体的融合电融合技术的优点：避免PEG、高pH、高Ca2＋这些非正常生理条件；融合条件数据化，便于控制与相互比较。其他方式融合

神舟四号飞船上进行的太空细胞顺利融合，返回舱里的电融合仪内孕育出首批国产太空生命。应用举例二十世纪80年代末，细胞电融合技术被用于从胚胎细胞克隆哺乳动物。

单克隆抗体制备G.Kohler和C.Milstein将能产生特异性抗体的原代B淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备这种革命性的制备抗体的方法。无数的融合产物经分离和筛选后，将符合要求的单个细胞作为克隆进行扩增，这就是使用“单克隆”一词的原因。这种融合产物被称为杂交瘤.三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1．互补选择法2、机械分离杂种细胞法3.双荧光标记选择法原生质体发生融合时，有相当一部分并未融合，或发生的是非目的性融合，所以会呈现多种融合状态，故有必要进行筛选出异核体，其主要方法有：1.互补选择法(1)遗传互补选择法

采用缺陷型亲本进行融合产生野生型杂种，从而从整体水平进行有效选择。另外也可以利用原生质体对药物，抗生素的不同抗性来进行筛选。

(2)营养互补选择法也称生理互补法

指亲本双方都有营养缺陷的情况下，只有杂种细胞能在选定的特种培养基上生存，而亲本双方皆不能生存.

如粉蓝烟