第二章工具酶第三章载体

第二章工具酶第三章载体第1页，课件共108页，创作于2023年2月第二章用于核酸操作的工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶第2页，课件共108页，创作于2023年2月（一）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的发现及其生物功能识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用hsdR：编码限制性核酸内切酶hsdM：编码限制性甲基化酶hsdS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出

HindII和HindIII

第3页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的类型主要特性I型II型III型限制修饰多功能单功能双功能蛋白结构异源三聚体同源二聚体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMATPMg2+SAMMg2+识别序列TGAN8TGCT旋转对称序列GAGCCAACN6GTGCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游随机性切割特异性切割24-26bp处第4页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的命名属名种名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感杆菌d株同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶第5页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点第6页，课件共108页，创作于2023年2月EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP第7页，课件共108页，创作于2023年2月PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP第8页，课件共108页，创作于2023年2月PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’第9页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1mg标准DNA所需的酶量第10页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’第11页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5MNaAcpH5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥第12页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间第13页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响

大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基第14页，课件共108页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶影响限制性核酸内切酶活性的因素核酸内切酶的缓冲液性质：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象

EcoRI在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘PuPuATPyPy3’或者5‘AATT3’第15页，课件共108页，创作于2023年2月（二）DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick第16页，课件共108页，创作于2023年2月DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键T4-DNA连接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’第17页，课件共108页，创作于2023年2月DNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

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…5’T4-DNA连接酶第18页，课件共108页，创作于2023年2月DNA连接酶DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量第19页，课件共108页，创作于2023年2月DNA连接酶平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM第20页，课件共108页，创作于2023年2月（三）DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的基本性质：3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI第21页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）缺口前移标记法大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Nicktranslation制备32P标记的探针DNaseIDNApolI第22页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性第23页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列第24页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

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OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第25页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

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OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’第26页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA酶的基本特性：在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性第27页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多第28页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶T4-DNA聚合酶T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘第29页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA第30页，课件共108页，创作于2023年2月DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶3’RNA5’

DNA3’5’3’RNA5’

DNA3’5’反转录酶5’

DNA3’第31页，课件共108页，创作于2023年2月（四）核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’第32页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）ExoIII3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外切第33页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶双链核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特异性地从5‘端外切3’5’3’5’第34页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillusoryzae）Zn2+必需最适pH范围为4.0-4.3需要NaCl10-300mM降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍第35页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs第36页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘第37页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶的重要用途：在DNA上定位RNA（S1mapping）DNAmRNA杂交S1EcoRI第38页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本特性:来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）Ca2+5‘dNMPs或5‘NMPsssDNAorRNACa2+Ca2+第39页，课件共108页，创作于2023年2月核酸酶单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变EcoRIABCEcoRIEcoRIBCABal31BCA环化AC第40页，课件共108页，创作于2023年2月（五）核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）TdT的基本特性：来自小牛胸腺不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs5‘p3‘HOOH3‘p5‘TdTMg2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAOH3‘p5‘第41页，课件共108页，创作于2023年2月TdT的基本特性：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOAAAAAAAAAAAAAAOH3‘

p5‘

AAAAAAAAAAA第42页，课件共108页，创作于2023年2月核酸修饰酶碱性磷酸单酯酶来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）5‘pOH3‘

DNAorRNA5‘pppdN5‘pppNBAP/CIPOH3‘

5‘HO5‘HOdN5‘HON第43页，课件共108页，创作于2023年2月核酸修饰酶T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5‘-OH上加磷5‘HO3‘HOOH3‘OH5‘T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）5‘p3‘HOOH3‘p5‘用于探针的末端同位素标记：第44页，课件共108页，创作于2023年2月第三章用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征第45页，课件共108页，创作于2023年2月载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件第46页，课件共108页，创作于2023年2月载体的功能及特征载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

具有合适的筛选标记具有较高的外源DNA的载装能力具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点第47页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中绝大多数的质粒是DNA型的绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA质粒DNA的分子量范围：1-300kb第48页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-3拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒10-60拷贝stringentplasmid第49页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coliColE1

plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’第50页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep第51页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容粒组成不相容性群第52页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势第53页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定第54页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的基本特征携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义第55页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101

8.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr第56页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10

表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒装有报告基因便于启动子等元件的克隆筛选第57页，课件共108页，创作于2023年2月质粒重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆第58页，课件共108页，创作于2023年2月质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’第59页，课件共108页，创作于2023年2月质粒重要的大肠杆菌质粒载体pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第60页，课件共108页，创作于2023年2月质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等第61页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法

质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法

质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法

质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间第62页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：

用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第63页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒DNA的分离纯化碱溶法：

用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物

加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA

cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA第64页，课件共108页，创作于2023年2月质粒质粒DNA的分离纯化沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA第65页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第66页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性：

生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成

l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因第67页，课件共108页，创作于2023年2月l噬菌体生物学特性：

生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA第68页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：

感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解第69页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：

感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA第70页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：

溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第71页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体第72页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）第73页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）第74页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点第75页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第76页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记imm434imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑第77页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：加装选择标记lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑第78页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体

琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株第79页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA载体的主要类型：插入灭活型载体Charon2、Charon6、lgt11取代型载体lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40正选择型载体lEMBL1、lL47、l1059野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑第80页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA重组分子的体外包装：l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的第81页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期

加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时

用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒

密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解

超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放l-DNA

乙醇或异丙醇沉淀l-DNA

第82页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌

l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量

重组l-DNA分子的筛选较为方便

重组l-DNA分子的提取较为简便

l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达

外源基因第83页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：

生物结构M13噬菌体的外型呈丝状M13

噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成

M13

DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13

噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长

第84页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13噬菌体的生物学特性：

感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第85页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinker第86页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大

但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb第87页，课件共108页，创作于2023年2月噬菌体或病毒DNA与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病

毒基因组DNA。动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。第88页，课件共108页，创作于2023年2月考斯质粒与噬菌粒

l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.5

kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，

考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。当然，由于考斯质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。第89页，课件共108页，创作于2023年2月考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有1978年Collins和Hohn发明构建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb第90页，课件共108页，创作于2023年2月考斯质粒与噬菌粒考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞第91页，课件共108页，创作于2023年2月考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞

装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA第92页，课件共108页，创作于2023年2月考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pUC118/119pUC118pUC18+M13间隔区IGpUC119pUC19+M13间隔区IG500个拷贝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13辅助噬菌体DNA第93页，课件共108页，创作于2023年2月考斯质粒与噬菌粒噬菌粒（phagemidorphasmid）重要的噬菌粒载体：pBluescript体外转录载体pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌体启动子PT3和PT7强化外源基因的转录提取出来的单链DNA重组分子在噬菌体RNA聚合酶的存在下，又可实现外源基因的体外转录第94页，课件共108页，创作于2023年2月人造染色体载体

人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，此时考斯质粒和