1组织工程概论2012

张延芳组织工程

(TissueEngineering)广东医学院物理教研室哪些器官可以造？2007年11月25日，一位英国老人离开了这个世界，享年68岁。这个年纪，在现代社会实在算不上高寿。然而，把时钟拨回到2000年，那一年，皮特·霍顿（PeterHoughton）经历了一次严重的心脏病，医生只许诺给了他6个星期的剩余生命。2000年6月20日，老霍顿被推出了英国牛津约翰拉德克利夫医院的手术室，从那开始，他成了一个“铁了心”—准确说是“钛了心”的男人。因为医生给他安装了一个名为Jarvik2000的钛金属装置，很多报道称之为一颗人工心脏，其实这是不准确的，它的确切名称是左心室辅助装置，简称LVAD（leftventricularassistdevice）。

人造心脏的患者模拟图一、什么是组织工程？组织工程是近年来正在兴起的一门新学科，属于生物高技术范畴。定义：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。

Tissueengineering“Theapplicationoftheprinciplesandmethodsofengineeringandlifesciencestowardthefundamentalunderstandingofstructure-functionrelationshipsinnormalandpathologicalmammaliantissueandthedevelopmentofbiologicalsubstitutestorestore,maintain,orimprovetissuefunction.”

这个专业术语直到1987（1988）年才由加利福尼亚大学，圣地亚哥分校的Y.C.Fung教授在国家科学基金会（NationalScienceFoundation）会议上提出并确定下来，随后这个领域如同雨后竹笋，有大量的研究开展起来，各种技术得到建立，相关的公司出现。据1997年的数据统计，在该领域注册的公司有35家，每年有430万美元用于产品的研究和开发。年增长率为20%。组织工程处于传统的医药工业和生物学革命之间，随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，必将会产生新一代的组织器官，组织工程产业将产生数亿美元的效益，预计到2020年将达到200亿美元。1.组织工程学目标：

干细胞变成人体器官

细胞的技术，具体方法是用生物可降解和相容性强的材料制造一种符合需要的器官或组织形态的支架，吸附在支架上面的干细胞按照特定的方式逐渐成长为所需要的器官组织，好像一群泥瓦匠用混凝土盖房子。

将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损病分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。2.基本原理和方法3.组织工程研究内容种子细胞研究细胞外基质的研究（支架）组织器官的构建组织工程临床应用

⑴种子细胞研究

种子细胞主要来源于自体、同种异体、异种组织细胞等。自体组织细胞应为首选。

①载体等技术用于细胞的快速增殖;②干细胞工程;③采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的老化;④采用各种方法（包括自身转化、化学、物理、病毒等方法）诱导细胞发生转化，使其倍增时间减少，永生化或生命期延长。⑶细胞外基质的研究（支架）均质状态的基质（蛋白多糖、糖蛋白）和细丝状的胶原纤维,是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。理想的应具有以下特点：①生物相容性好；②可吸收性；③可塑性；④表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附和生长；⑤降解速率可根据不同细胞的组织再生速率而进行调整。组织工程所应用的材料：

①天然ECM

：用胶原制作人工皮和血管的模型；②人工的ECM：聚乳酸、聚羟基乙酸、两者的共聚物（PGA-PLA）、聚ρ-羟基丁酯（PHB）；聚乳酸-已内酯的共聚物（PLC）、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐；③天然高分子合成高分子的复合物，如胶原-PCA的复合物等；④有机材料与无机材料的复合物，如羟基磷灰石-甲壳素的复合物，羟基磷灰石-PLA的复合物。⑶组织器官的构建

①骨组织构建：支架材料与成骨细胞；支架材料与生长因子；支架材料与成骨细胞加生长因子。

②组织工程血管构建：血管壁中切取弹性基膜，并在其上培养动脉平滑肌细胞；或用I型胶原制备基质材料与各型血管壁细胞成分合成血管模型。⑷组织工程临床应用

组织工程中临床应用是在组织构建完成了动物试验之后，在人体上的应用，这也是组织工程的最后一步。目前，组织工程的研究只有活性皮肤达到了这一步。骨组织工程支架材料神经组织工程支架材料血管组织工程支架材料肌腱组织工程支架材料皮肤组织工程支架材料角膜组织工程支架材料肝、胰、肾、泌尿系统组织工程支架材料二、组织工程支架材料必备的两个功能

（1）有一定机械强度以支撑组织的高强度材料，以保证材料植入人体后，有支撑体的重量，不改变骨骼形状。

（2）有一定生物活性可诱导细胞生长、分化，并可被人体降解吸收。①骨组织工程支架材料

纤维蛋白凝胶、胶原凝胶、聚乳酸、聚醇酸及其共聚体、聚乳酸和聚羟基酸类、琼脂糖、壳聚糖和透明质酸等多糖类。分类：生物降解和非生物降解型高聚物（碳素纤维，涤纶，特氟隆），金属材料（不锈钢，钴基合金，钛合金），生物惰性陶瓷（氧化铝，氧化锌，碳化硅），生物活性陶瓷（生物玻璃，羟基磷灰石，磷酸钙）等。1998年，一只背上长着人耳朵的老鼠震撼了全世界.

曹谊林

国家组织工程中心主任、973计划“组织工程学重要基础科学问题研究”项目首席科学家，上海交通大学医学院附属第九人民医院副院长。

1989年，查尔斯·瓦康提正在作一项软骨培养实验。软骨是构成我们关节面、耳朵、鼻尖、气管的组成成分，也就是脆骨。在体内，软骨一旦损伤很难再生，特别是那些大关节的软骨，由于软骨磨损出现的关节病十分常见，其中又以膝关节软骨损伤为甚。查尔斯在人体内分离出那些可以分化成软骨的细胞，作为种子，放置在用聚乙醇酸和聚乳酸编织的模板上。瓦康提和他的同事们终于制造出了一个大约3岁孩子的耳廓模型。瓦康提和他的同事选择了裸鼠。裸鼠是一种特殊的实验鼠，它生来没有胸腺，这使得它的免疫能力十分低下，至于无毛，那只是一个“赠品”。几乎没有免疫力的裸鼠对于任何外来的细胞都没有反抗能力，这使得它成了研究肿瘤和移植的最好样本。曹谊林把模板固定在裸鼠背部皮肤之下，上面播撒上牛的成软骨细胞。在裸鼠无私的滋养下，牛软骨细胞逐渐长满了人耳模板，并逐步将其降解，最终成了一个长在老鼠背上的“人耳朵”.”。2001年，已经返回国内的曹谊林教授接诊了一名7岁的小男孩，他在一次车祸中失去了6厘米×6厘米大小的颅骨，这相当于他颅骨面积的六分之一。传统的做法是使用别的材料来修补这个破洞，但这个孩子还这么小，他的头骨还会不断地长大。曹教授大胆借鉴了几年前在裸鼠身上长“人耳”的成功经验，他首先给小患者作了详细的头部扫描，用计算机构建出缺损颅骨的三维模型，然后用可降解材料制造一个相同立体结构的模板。

图一：一名7岁男孩沈某因车祸造成颅骨6×6厘米缺损图二：采用组织工程技术构建的颅骨移植修复，经4个月随访，这块占颅骨总面积达1／6的组织工程化颅骨在人体内稳定存在，生长良好。从小男孩体内提取出成骨细胞，种植在模板上，埋在小男孩体内。待骨细胞已经长满了模板，便将其取出修补在头上的破损处。这样，曹教授等于把因为车祸失去的那块骨头又变了回来。这个成功的病例轰动了世界。2008年11月英国著名的医学杂志《柳叶刀》报道了一例人造气管移植的成功病例。多国医疗团队成功地给一名因患肺结核导致左侧气管坏死的30岁女病人移植了一个人造气管。与曹谊林教授的人造颅骨一样，在个病例里，医生们也提取了病人的成软骨细胞，但他们没有费力制造模板，而是借了一个现成的用—医生从一具捐赠的遗体上切下7厘米长的气管，然后用各种酶消化掉了其中的细胞，仅仅留下细胞外基质，这是一个完美的模板，同时由于没有任何细胞，用这个模板生成的新气管也不会出现移植排异反应。

人造气管刘鸿清是康奈尔大学生殖医学中心生殖内分泌实验室的主任，她和同事一起用胶原蛋白做模板，用子宫内膜细胞做种子，培育出了微型的人类子宫和全尺寸的小鼠子宫。其中那个小鼠子宫孕育了一个小鼠胚胎—从受精卵到几乎足月；而微型人类子宫也成功地让一枚人的受精卵着床生长了6天。有些人甚至已经开始担心人造子宫将会给未来社会造成的种种麻烦了。人造子宫

比如，模拟血液的功能，可以制造、传递养料及废物，并能与氧气及二氧化碳自动结合并分离的液态碳氢化合物人工血；模拟肾功能，用多孔纤维增透膜制成血液过滤器；模拟肝脏，根据活性碳或离子交换树脂吸附过滤有毒物质；模拟心脏功能，用血液和单向导通驱动装置，组成人工心脏自动循环器。

预计到21世纪中后期，除脑以外人的所有器官都可以用人工器官代替。

⑵神经组织工程支架材料理想的人工神经是一种特定的三维结构支架的神经导管，可接纳再生轴突长入，对轴突起机械引导作用，雪旺细胞支架内有序地分布，分泌NTFs等发挥神经营养作用，并表达CAM、分泌ECM，支持引导轴突再生。

以往用于桥接神经缺损的神经套管材料有硅胶管、聚四氟乙烯、聚交酯、壳聚糖等。目前用于人工神经导管研究的可降解吸收材料有聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）及它们的共聚物等。神经支架材料的功能有两种（1）必须为神经恢复提供所需的三维空间，即要保证神经导管具有合适的强度、硬度和弹性，使神经具有再生的通道。（2）要保证其有理想的双层结构：外层提供必要的强度，为毛细血管和纤维组织长入提供营养的大孔结构；内层则可起到防止结缔组织长入而起屏障作用的紧密结构。

⑶血管组织工程支架材料

结构分为双层：内层是与血液相容性好的生物活性材料，该类材料要求不仅具有生物活性，同时还要具有抗凝血和抗溶血作用。类型：最早的外层材料一般为尼龙、聚酯等无纺布或无纺网等。目前，该类材料应用较多的为胶原或明胶蛋白包埋的或表面处理的可降解材料的无纺网，例如：聚乳酸、聚羟基酸和多肽等的无纺布无纺网等。⑷肌腱组织工程支架材料

肌腱与韧带组织中的功能细胞分别是肌腱细胞和成纤维细胞，二者在组织来源上均属成纤维细胞型，但肌腱细胞分泌Ｉ型胶原，而成纤维细胞分泌Ｉ、Ⅱ型胶原。因此，肌腱组织支架材料必须可降解，但一定要是降解时间较长的材料。类型：20世纪70年代肌腱支架材料一般使用硅橡胶、尼龙聚酯、碳纤维等，目前使用的多是聚酯聚二氧杂环烷等。⑸皮肤组织工程支架材料⑹角膜组织工程支架材料

人工角膜材料要求透明，吸水，有一定的机械强度，屈光性好等特点，同时，要求可降解。以前常用的材料为聚甲基丙烯酸甲酯PMMA，近来来，多采用胶原和聚醇酸等材料。⑺肝、胰、肾、泌尿系统组织工程支架材料

肝、胰、肾、泌尿系统使用的组织工程支架材料多为可降解材料，目前这方面研究和使用的材料，主要以天然蛋白、多糖与合成高聚物杂化的可降解材料。例如：用于肝组织工程支架的血纤维和聚乳酸，用于泌尿系统的聚乙醇酸等。⑻用于组织工程的新肽生物材料支架(1)易于设计和修饰的基本单元；(2)材料的生物降解速度可调控；(3)没有细胞毒性；(4)具有能特异促进或抑制细胞-材料相互作用的特性；(5)能引发的免疫反应和炎症最小；(6)材料的生产、纯化和处理是容易的(7)与水溶液和生理条件的化学相容性。自然来源的材料几种自然来源的动物产物如基于胶原蛋白的生物支架，它们的衍生物和生物相容性同聚物已用于细胞吸附的支架。合成的肽生物材料支架合成生物材料的最大优点是他们能被设计成符合特定的需要的东西。通过插入能促进细胞吸附的生物活性基序的例子表明了这样设计的可塑性。组织工程和修复生物材料已广泛用于组织工程。最近在生物材料和细胞相互作用的工作集中在空腔（膀胱）和骨组织工程的生物材料的物理特性和维度。

设计更好的人工肽生物材料支架未来在合成的生物材料支架的工作将注重具有更复杂的材料几何构象和诸如更强的抗拉能力的生物材料的设计。将生物活性基序插入肽生物材料中将刺激编织这些材料成良好结构的处理过程的发展。三、组织工程的任务与发展

制造可生物降解并且不会诱导瘢痕组织形成的新材料。

从骨髓中分离出细胞和起源细胞的培养物而同时又不含结缔组织细胞如成纤维细胞。生物反应器中大量培育细胞的更加先进的方法。

组织工程产品在从工厂到手术室的途中以良好的功能状态存活，不会在移植过程中死去。1、任务组织工程学在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织、器官的一部分或全部功能，或作为一种体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生活、生存质量，延长生命活动的目的。核心是活的细胞、可供细胞进行生命活动的支架材料以及细胞与支架材料的相互作用，这是组织工程学研究的主要科学问题。2、组织工程学的发展①随着人类物质、文化生活水平的提高，对损伤、疾病的治疗要求越来越高，不仪要求治好伤、病，还要求良好的功能及完美的外形，应用传统的治疗方法难以达到如此完善的地步，需要寻找新的治疗途径。②科学技术总体水平的提高，为患者、医生对治疗提出的高要求有实现的可能，如完善的细胞培养技术和可控降解的高分子材料的问世，为体外构建“组织”、“器官”提供了条件。③高、新技术的开发与利用是组织工程学研究的基础，如基因工程技术、免疫隔离技术等为改造细胞提供了新方法。④巨大的市场需求为组织工程学发展注入了动力。众多的投资公司注入大量资本进行组织工程学研究。这些是组织工程学研究发展的基础与动力。3.组织工程学研究的科学问题A种子细胞的研究。B支架材料及细胞外基质的研究。C体内植入研究。D检测方法及检验标准。E临床验证研究。F产业化研究。（1）种子细胞的研究

自体、异体、异种各种组织细胞的分离培养技术，细胞生物学行为，多种细胞的复合培养技术；细胞因子的有序作用、信息传递及其调控；建立实验标准细胞系，改造种子细胞，延长细胞寿命及生存期；改变细胞表面结构，研究细胞粘附及抗粘附力的技术及其影响机制；研究降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受的方法

1990年举办第一屆组织工程学术研讨会，1995年发行专业期刊

TissueEngineering

人造组织目前发展方向：皮肤、神经、肌肉骨骼系统(硬骨,软骨,肌肉)、心血管系统(血管,心辦膜)、內分泌器官(肝,胰,肾).人体组织由细胞及支撑细胞的细胞外间质(extra-cellularmatrix)构成

细胞必须能不断进行细胞周期(cellcycle)

，即不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定之组织之细胞。干细胞(stemcells)。体细胞(somaticcells)。（2）支架

组织生长支架需求：

1.生物亲和性

2.生物可降解性(biodegradable)

3.三维內部连通孔隙

4.具备支撑强度如何更精確的控制组织生長支架的降解与支撑强度间之关系?如何引导细胞向支架内部及顶端生长?如何增进细胞的生长效率?以非均质性之支架结构，控制不同时期的降解速率。以超音波或电磁场等物理源，配合支架中添加细胞黏附附蛋白，促进细胞增生及导引细胞生长方向。生物反应器(bioreactor)系统做为组织工程培养系统。（3）解决方案：组织工程为解除病人痛苦提供了一种新的治疗方法，更主要的是提出了复制“组织”、“器官”的新思想，它标志着“生物科技人体时代”的到来，是“再生医学的新时代”，是“一场深远的医学革命”；因此，组织工程学一经提出即受到各国科学家、政府、企业界的极大重视。

（4）经济效益组织工作研究具有巨大的潜在经济效益，因此引起美国企业界的极大重视。据不完全统计，在美国已有20多家上市公司为组织工程开发、研究提供资金，一些大的公司投入数千万到2亿美元进行研究。据预测在今后几年时间内，组织工程产品将有800亿美元的收入，成为美国经济的支柱性产业之一。（5）临床应用这一新兴的研究领域涉及到了材料学、工程学及生命科学。在医学领域，包括基础医学的遗传学、组织胚胎学、细胞生物学、分子生物学等；在临床医学领域包括骨科、整形外科、胸外科、神经外科、口腔颌面外科、五官科、普外科、康复医学等。将骨生长因子或干细胞植入一种做成特别形状的孔状材料中，制造新的下颌或肢体。一种能制造胫骨的产品正处在临床试验中。

公司：CreativeBiomolecules,Orquest,SulzerOrthopedics,Biologics,GeneticsInstitute,OsirisTherapeutics,Regeneron。Organogenesis公司研制的与人类皮肤相同的Apligraf，是第一个获得食品及药物管理局（FDA）批准的人造组织。它最初用于治疗腿部溃疡，也可用于治疗足部溃疡和烧伤。

公司：Organogenesis,AdvancedTissueSciences,IntegraLifeSciences,LifeCell,OrtecInternational。从猪的身上提取大量的可制造胰岛素的细胞，将其植入包膜中，然后注入人体腹部。这种方法已在动物身上进行了试验，在两年内可能用于人体临床试验。

公司：BioHybridTechnologies,Neocrin,CirceBiomedical。

由第四军医大学组织工程与实验中心教授金岩和陕西艾尔肤组织工程有限公司的工程技术人员承担的陕西省重大科技产业化项目“人造皮肤”，经过十多年的努力，着重解决了大规模细胞培养技术、生物材料技术、培养系统技术和保存运输技术4项技术，申请了“组织工程皮肤的制备”等5项国家发明专利，完善了组织工程双层皮肤新产品“安体肤”的生产工艺。国家食品药品监督管理局先后4次组织专家进行严格评审，最近正式为人造皮肤颁发了医疗器械产品注册证书。

陕西艾尔肤组织工程有限公司年产300万平方厘米组织工程皮肤产业化暨陕西省组织工程技术研究中心项目奠基。这是迄今为止我国唯一研究成功并具有完全自主知识产权的组织工程产品，标志着我国组织工程产业的研究达到国际先进水平。据了解，该项目的研发工作始于1997年，2001年完成了动物实验；2002年列为国家“十五”863计划项目；2004年底，完成了300余例临床实验，取得理想效果；2007年11月获得了SFDA颁发的产品注册证书。作为陕西艾尔肤组织工程产业化基地的一期建设项目，本工程占地面积15.45亩，主厂房建筑面积约1万平方米，为三层砼框架结构，项目总投资1.2亿元，计划今年8月竣工投产。达产后，可生产组织工程皮肤300万平方厘米、组织工程角膜1千枚、选择性脱细胞双层皮100万平方厘米，年销售收入达到10亿元以上。一项为期10年的制造心脏的首创行动已拉开序幕。基因改造后的蛋白质已成功地被用于血管再生。

公司：Organogenesis,AdvancedTissueSciences,Genetech,LifeCell,Reprogenesis。

心脏瓣膜、动脉及静脉尿道从病人身上取出软骨细胞，将它们放入一个较小的基质中，然后植入受损的输尿管中。从而使管壁增强，以阻止尿液回流及失禁。该方法已处于临床试验后期。

公司：Reprogensis,IntegraLifeSciences。耳软骨一种能够使膝关节软骨再生的产品已经面市。已为一个男孩培养了一个胸廓并在裸鼠身上制造出了人耳。

公司：GenzymeTissue,Biomatrix,IntegraLifeSciences,AdvancedTissueSciences,ReGenBiologics,OsirisTherapeutics。

牙齿珐琅质基质蛋白被用来填充龋齿洞，在狗身上已获得成功。几年后有望进行人体试验。

公司：Biora,AtrixLaboratories,CreativeBioMolecules。乳房在临床使用前的研究中，几家公司已经能够通过植入一个软骨球，制造一个装饰乳头。研究人员目前正在试图培养一个完整的装饰乳房。

公司：Reprogenesis,IntegraLifeSciences。肝脏制成一个海绵状的包膜，然后将肝脏细胞植入其中。已培养出一个10美分大小的器官，但由于肝脏结构较为复杂，要培养出整个肝脏可能要花10年的时间。

公司：AdvancedTissueSciences,HumanOrganSciences,Organogenesis。膀胱波士顿儿童医院的医生已用皮肤细胞培养出膀胱并将它们植入绵羊体内。他们准备将同样的方法用于病人身上。

公司：Reprogenesis。脊髓神经科学家们正在研究神经生长因子，并将其植入受损处，以促使神经再生，或者将它们接种在可进行生物降解的人工材料上并植入神经缺损处。按此方法处理的老鼠已能够再次行走。四、组织工程存在的问题

尽管国内外组织工程研究已经取得令人瞩目的阶段性研究成果。目前利用细胞和可降解聚合物再造人体组织和器官的组织工程研究仍面临众多艰巨挑战。1.移植细胞来源以及实现细胞的商业化。2.研制具有完全仿生的人工ECM支架材料。3.组织工程化产品体外培育条件的优化。4.为建造大的组织或器官提供血运保障。5.建立组织工程产品的质量控制体系。

应用于组织工程的大多数载体材料可以归纳为两类之一：合成材料；天然材料。

从仿生学角度分析，目前无论合成材料，或天然材料均不具备细胞外基质的功能和作用，因此，研制新型仿生支架材料是组织工程支架材料的发展趋势之一。

现在，研究人员正在试图综合上述两类材料的最佳优点，来设计具有特殊性能的新一代材料。例如，一些研究人员正在构建含有模拟特定天然ECM活性区域的生物材料。

另外一些的科学家则正在试图研制含有导电性的聚合物，这种材料可能在组织工程神经生长方面非常有用，或者研制能够快速胶化的聚合物。

如何按照人体组织配件工厂要求，对组织工程化产品体外培育条件进行优化是组织工程研究面临的挑战之一。

目前，实验室条件下，进行组织工程产品体外培育存许多问题。在这种条件下产生的组织片常常比需要的薄，所建造的组织无论是在质上或量上均难以完全满足临床实际需要，更无法进行大规模商业化生产。

国内外研究人员目前正在研制、开发能够为体外生长的人体组织提供最佳条件的装置，其中，已经研制的旋转生物反应器即是进行细胞、组织体外培育的先进装置。

随着培育组织在生物