测定食品中蛋白质含量

Lowry-Folin法测定食品中蛋白质含量食品学院第7组S100111029王婷一、 实验目的：熟悉并使用分光光度计。学习并理解Lowry-Folin法测定食品中蛋白质含量的方法。二、 实验原理：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸（Folin）试剂还原，产生深蓝色络合物。在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定蛋白质的含量。这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的金典方法之一。三、 实验试剂：试剂A：称取Na2CO3100g溶于1000ml（最终体积）0.5mol/LNaoH中。试剂B：称取CuSO4-5H2O1.0g溶于100ml（最终体积）蒸馏水中。试剂C：称取酒石酸钾钠2.0g溶于100ml（最终体积）蒸馏水中。牛血清蛋白（BSA）标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配成浓度为200ug/ml的溶液。5.2mol/LFolin-酚试剂：于2L的磨口烧瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4・2H2O）、25g钼酸钠（Na2MO4-2H2O）＞700ml蒸馏水，在加入85%磷酸溶液50ml以及浓盐酸100ml，充分混合，接上冷凝管，回流10h。回流完毕，加入150g硫酸锂、50ml蒸馏水和浓漠水（90%）数滴，开口继续煮沸15min，以除去多余的漠（冷却后如仍然有绿色需再加漠水，在煮沸）。冷却后加水定容至100ml。混匀，过滤，制的的试剂应呈金黄色，置于棕色瓶中保存。使用时一酚酞作为指示剂，用标准溶液滴定，用蒸馏水稀释（本处为10倍），使其达到所需浓度。四、 实验步骤：标准曲线的绘制：（1）取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置于相应的试管中。在各支试管中分别加入1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.00ml的蒸馏水，使其总体积达到1ml。

不同浓度BSA溶液的配制编号0（空白）12345BSA(ml)00.200.400.600.801.00水(ml)1.000.800.600.400.200.00BSA质量(ug)04080120160200（2） 取试剂A15.00ml,试剂B0.75ml,试剂C0.75ml,在50ml三角瓶中混匀，在每支试管中分别准确加入此试剂1.00ml，充分摇匀，静置15min。（3） 分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液3.00ml，立即震荡，充分摇匀。（4） 静置45min，在540nm波长下测定每个试管中也的吸光度（A值）。（5） 以A值为纵坐标，BSA质量（0〜200ug）为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数R2。样品的测定将啤酒样品适当稀释，吸取2份，各1.00ml，重复步骤（2）〜（4）。编号空白1编号空白12345样1样2平均BSA(ug)04080120160200110.12吸光度0.0000.1330.2360.3430.4330.5450.3060.3310.318五、实验记录和数据处理0.6「0.5-0.4-0.3-0.2-0.1- A0 0 5当Y=0.318时，x=113.57样品中蛋白质的含量（mg/ml）=XaXNX0.001=113.57X20X0.001=2.27六、说明1加入Folin-酚试剂后立即将反应摇匀，以便Folin-酚试剂在碱溶液中破坏之前即能被铜-蛋白质复合物还原。短时间内反应液的颜色保持稳定，因此，静置45min后反应立即测定吸光度，若拖延时间过长，颜色将会变化，影响结果。七、思考题1测定食品中蛋白质含量的常用方法有哪些，其原理、适用性如何。答：（1）凯式定氮法原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。适用性：凯氏定氮法适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时试剂消耗量大。凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。（2） Lowry-Folin法原理：在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐课产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸（Folin）试剂还原，产生深蓝色络合物。在一定条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定蛋白质的含量。适用性：这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。（3） 紫外吸收法原理：蛋白质分子中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。适用性：紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。（4） 考马斯亮蓝法（Bradford）原理：Bradford法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为59nm，蛋白质在1-1000Mg范围内，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比故可用于蛋白质的定量测定。适用性：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速而稳定，2min左右即达到平衡，其结合物室温下1h内保持稳定，且在5〜20min之间，颜色的稳定性最好。该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。(5)双缩月尿法(Biuret)原理：在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。适用性：双缩尿法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响，采用0.5g样品，40mL双缩尿试剂的比例具有较高的检测精度。双缩尿法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为1〜20mg蛋白质。适用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物