经典免疫学技术课件

现代免疫分析技术

经典免疫学技术现代免疫分析技术

经典免疫学技术免疫分析技术的发展多元免疫技术免疫沉淀免疫凝集补体结合反应中和反应免疫标记技术经典免疫学方法化学发光胶体金酶免疫免疫荧光放射免疫PCR-免疫分析时间分辨荧光分析免疫分析技术的发展多元免疫技术免疫沉淀免疫标记技术经典免疫学Chapteroutline沉淀反应（Precipitation）凝集反应（Agglutination）补体结合反应中和反应Chapteroutline沉淀反应（Precipi概念：沉淀反应又称免疫沉淀反应，是指可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病理浸出液或血清以及其他来源的蛋白质、多糖、类脂质体等）与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现的蛋白质析出现象。

A.

Precipitation

原理：蛋白质表面—极性分子—水膜

适量电解质+比例适合的抗原抗体=沉淀

概念：沉淀反应又称免疫沉淀反应，是指可溶性抗原（如细菌浸出液

A.

Precipitation

沉淀反应的类型溶液中沉淀反应凝胶中沉淀反应絮凝沉淀试验，环状沉淀试验，免疫比浊法，免疫沉淀技术，免疫共沉淀技术

单(双)向免疫扩散，免疫电泳，对流免疫电泳，火箭免疫电泳，交叉免疫电泳，免疫固定电泳，免疫印记技术A.Precipitation沉淀反应的类型溶液中1.溶液中的免疫沉淀反应1.溶液中的免疫沉淀反应Negativetest

PositivetestUsesfineparticlesofantigentodetectantibodyinpatient’sserum.1.1絮凝试验(Flocculation)抗原抗体比例是关键！稀释法、方阵滴定法。梅毒的检测Negativetest PositivetestUs1902年，Ascoli建立。早期用途：兽类内脏、皮毛浸液等标本中的炭疽杆菌抗原。

1.2环状沉淀试验(ringprecipitationtest)抗血清抗原37℃与絮凝实验相比：减少了反应体积；提高了反应灵敏度。可用于较少量的抗原检测，如血迹分析、病原昆虫的流行病学分析。1902年，Ascoli建立。1.2环状沉淀试验(r原理：抗原抗体充分反应后，所形成的絮状或颗粒抗原抗体复合物会增加反应体系的浊度。特点：现代光学技术与自动分析技术相结合，提高了灵敏度和易操作性。分类：透射比浊法、散射比浊法（灵敏度高）

1.3免疫比浊法(Immunoturbidimetry)YYY原理：抗原抗体充分反应后，所形成的絮状或颗粒抗原抗体复合物会光线穿透待测溶液时，会受到抗原抗体复合物的作用而发生散射，散射光的强度与复合物的含量以及散射夹角成正比，因此可以通过测定散射光强度的变化来推测抗原抗体反应的情况。LightsourceDetector1.反应动力学测定2.快速、敏感、精确度高（ng）3.仪器价格昂贵、对抗体要求高散射比浊法(Nephelometry)光线穿透待测溶液时，会受到抗原抗体复合物的作用而发生散射，散利用抗原抗体的特异性结合作用，使靶蛋白（抗原）形成抗原抗体复合物并最终从溶液中沉淀出来。第一阶段改进：改变反应条件促进抗原抗体多聚物形成，使其更加容易沉淀。第二阶段改进：加入二抗，促进更大的抗原抗体网络形成。第三阶段（20世纪70年代）改进：采用固相载体提高对靶蛋白的沉淀。细菌蛋白质A，细菌蛋白质G。1.4免疫沉淀法(immunoprecipitation)利用抗原抗体的特异性结合作用，使靶蛋白（抗原）形成抗原抗体复免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是利用抗体将相应蛋白沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子同时被沉淀出来。通过进一步与其他技术结合，如SDS，Westernblot可以进一步对靶蛋白质进行分析。以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。1.5免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation)免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是经典免疫学技术课件相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，保持了蛋白质的天然活性；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；如用westernblot检验，必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结果。优点缺点相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，保持了蛋白质的天然活性；2.凝胶中的免疫沉淀反应2.凝胶中的免疫沉淀反应2.1单向免疫扩散(SingleImmunodiffusion)凝胶中抗原或抗体其中之一保持相对静止，通过对应的抗原或抗体分子的运动而在合适的位置上形成沉淀。可用于抗原或抗体的定量。2.1单向免疫扩散(SingleImmunodif

2.2双向免疫扩散(DoubleImmunodiffusion/OuchterlonyMethod)Testingperformedinagargel.Antigenisplacedinonewell.Antibodyisplaceinotherwell.Eachdiffusesthroughgel.Ifantibodyisspecifictothatantigen,aprecipitinlinewillformwherethe2meet.Ag01/4Ab1/2Ab1/1Ab1/16Ab1/8Ab2.2双向免疫扩散Testingperformed2.3免疫电泳

(Immunoelectrophoresis)琼脂平板电泳+双向扩散2.3免疫电泳(Immunoelectrophoresi

2.4火箭免疫电泳

(Rocketimmunoelectrophoresis)单向扩散+水平琼脂电泳pH条件：抗体分子不带电荷，抗原分子带负电荷。2.4火箭免疫电泳(Rocketimmunoelec

2.5交叉免疫电泳

(Rocketimmunoelectrophoresis)双向火箭电泳（电场方向垂直的两次电泳）抗原根据不同迁移率分离抗原抗体复合物形成火箭峰2.5交叉免疫电泳(Rocketimmunoelec

2.6免疫固定电泳(ImmunofixationElectrophoresis)与免疫电泳原理相同。电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，形成的复合物嵌于固相支持物中。洗去游离的抗原抗体后，染色观察被固定的区带。

Anode

PatientserumCathode(+electrode)(-electrode)Applicationpoint2.6免疫固定电泳(ImmunofixationElWesternblotting(Immunoblotting)1979，Rebart&TowbinIdentificationofproteinantigenfollowingSDS

2.7免疫印记(Immunoblotting)WesternblottingSDSIFE（固免）•高分辨率•操作简单•高特异性•高灵敏度Westernblotting(ImmunoblottiSeparateproteinsbySDSPAGETransferproteinstomembranes(i.e.Nitrocellulose)Blocknon-specificsitesonmembraneIncubatewithprimaryantibody,washIncubatewithsecondaryantibody,washDetectsecondaryantibody

2.7免疫印记(Immunoblotting)SeparateproteinsbySDSPAGE

2.7免疫印记(Immunoblotting)2.7免疫印记(Immunoblotting)颗粒型抗原或细胞型抗原与相应抗体结合后，在有适当电解质存在下，抗原与抗体充分反应，相互聚集，形成肉眼可见的凝集块团。B.凝集反应Agglutinogen

抗原性质，反应方式，实验目的---

直接凝集反应（Directagglutination）

间接凝集反应（Indirectagglutination）

血凝和血凝抑制反应

（InhibitionofAgglutination）颗粒型抗原或细胞型抗原与相应抗体结合后，在有适当电解质存在下细菌、螺旋体或红细胞与其相应抗体直接混合，经一定时间，形成细菌或红细胞凝集。Oftenperformedatroomtemperature.Mayusecentrifugationtobringantigenandantibodyintocloserproximity.某些病原菌感染的检测（伤寒、副伤寒）。Clickonimageatrightwaitforanimationtobegin.

1直接凝集DirectAgglutination细菌、螺旋体或红细胞与其相应抗体直接混合，经一定时间，形成细载体种类：血细胞聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化）2间接凝集PassiveAgglutination与直接凝集不同，间接凝集反应中的可溶性抗原或抗体需要吸附或偶联在一种与免疫无关的、具有一定大小的不溶性颗粒物的表面，使其成为致敏载体。间接血凝试验，胶乳凝集试验，活性碳粒试验正向间接凝集反应，反向间接凝集反应

载体种类：2间接凝集与直接凝集不同，间接凝集反应中的Antigensonacarriermolecule,suchaslatex,combinewithpatient’ssampleforantibodydetection.Clickonimageabovewaitforanimationtobegin.2.1正向间接凝集ForwardPassiveAgglutinationAntigensonacarriermoleculeAntibodyisboundtothecarriermolecule,whichisthenmixedwithpatient’ssampletodetectantigen.Clickonimageabovewaitforanimationtobegin.2.2反向间接凝集试验ReversePassiveAgglutination提高了单纯抗原抗体反应的灵敏度对微量抗原（真菌毒素）检测具有一定优势AntibodyisboundtothecarriAntibodyreagentiscombinedwithpatient’sspecimen.Ifpatient’sspecimencontainstheantigenforthatantibody,theywillreact.Erythrocyte（红细胞）isadded.Apositivereactionwillshownoagglutination.Anegativereactionshowsagglutinationbetweenreagentantibodiesandantigen.YYYYYY3血凝抑制反应InhibitionofAgglutination+-含血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现象！AntibodyreagentiscombinedwJulesBordet（1870-1961）Discovererofcomplement19世纪末概念：新鲜血液中含有的一种不耐热成分，可辅助和补充特异性抗体介导的免疫溶菌、溶血作用；特点：补体的激活没有抗原抗体特异性；原理：作为一种通用试剂来检测反应体系中抗原抗体复合物的存在，并利用补体对红细胞的裂解作用，通过红细胞的变化可以很容易的对反应进行示踪。

C.补体参与的抗原抗体反应JulesBordet（1870-1961）概念：新鲜血液补体结合试验原理受检系统指示系统溶血反应补体结合试验1.仅有抗原或抗体补体红细胞溶血素阳性阴性2.抗原抗体反应红细胞溶血素阴性阳性