植物MS组培实验

1.实验流程（1） 实验总流程：MS母液培养基的配置一胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制一胡萝卜愈伤组织诱导一胡萝卜愈伤组织的继代培养一观察记录（2） 无菌操作流程：实验员消毒一实验室、无菌台灭菌一实验器材的灭菌一无菌接种一消毒一实验台卫生（3） 胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置一胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装一胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌一取材及材料的消毒灭菌一接种与培养（4） 胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：器械及实验者的消毒灭菌一剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织一胡萝卜愈伤组织接MS液体成份的配制二、 实验基本原理MS培养基是Murashige和Skoog（二人缩写）于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，其养分的数量和比例合适，是较稳定的离子平衡溶液，能满足植物细胞的营养和生理需要，适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。三、 实验仪器与与试剂1、 实验仪器：1000ml/500ml量筒4个、250ml三角瓶（每人2个）、1000ml烧杯或塑料量杯5个、1000ml试剂瓶5个、10只100mL试剂瓶、微波炉、10ml离心管15个、玻璃棒5个、电子天平、称量纸、卷纸、移液枪（1000|iL、100J1L）、药勺。2、 实验试剂：见下述实验方案中所列。四、 实验方案与操作1、 大量元素20X母液配制（贮备液I）配制20X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。KNO3 1900mg/L（1.9g/L）NH4NO3 1650mg/L（1.65g/L）KH2PO4 170mg/L（0.17g/L）MgSO4.7H2O 370mg/L（0.37g/L）CaCL.2HO 440mg/L（0.44g/L）（可单独瓶配制存放）2 22、 微量元素100X母液（贮备液II）配制：配制100X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。KI 0.83mg/L（先配母液：0.83gKI溶于8mL水）

H3BO3MnSO4.4HH3BO3MnSO4.4H2OZnSO4.7H2ONa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2O22.3mg/L（先配母液：0.22g溶于8mL水）8.6mg/L（先配母液：0.86g溶于8mL水）0.25mg/L（先配母液：0.25g溶于8mL水）0.025mg/L（先配母液：0.25g溶于8mL水）0.025mg/L（先配母液：0.25g溶于8mL水）3、铁盐100X母液（贮备液III）配制100X（倍）浓度大量元素母液1000mL,按顺序充分溶解后再加后一个试剂。Na2EDTA.2炒。 37.3mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L4、有机成分100X母液（贮备液IV）配制100X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。肌醇甘氨酸盐酸硫胺素肌醇甘氨酸盐酸硫胺素（VB1）盐酸毗哆醇（VB6）烟酸（VB5）5、植物生长调节剂的配制:2mg/L（先配母液：0.2g溶于8mL水）

0.1mg/L（先配母液：0.02g溶于8mL水）

0.5mg/L（先配母液：0.05g溶于8mL水）

0.5mg/L（先配母液：0.02g溶于8mL水）6-BA（1mg/mL）：称10mg6-BA先溶于1mL1M盐酸充分溶解，再加9mL以蒸馏水，混匀。NAA（1mg/mL）：称10mgNAA先溶于1mL95%乙醇充分溶解，再加9mL以蒸馏水，混匀。五、实验注意事项1、 配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；2、 pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值MS固体培养基的配制与灭菌二、实验仪器与试剂1、 实验仪器高压灭菌锅、微波炉、100-200个组培瓶、pH试纸、4个1000mL量筒、4个1000mL塑料量杯、4只玻璃棒、移液枪（1000UL、100^L）、称量纸、卷纸、电子天平、药勺2、 实验试剂：10%NaOH、1MHCl、蔗糖，琼脂三、实验操作步骤1、在1000mL塑料量杯中，先加入800mL双蒸水，再按比例依次加入下列MS成份:大量元素20X母液：微量元素100X母液、铁盐100X母液、有机成份100X母液

50mL10mL10mL10mL50mL10mL10mL10mL最后再用约双蒸水（约120mL）定容到1000mL，充分混匀。静置30min，观察无沉淀方可用。2、 称取并继续加入蔗糖30g，琼脂粉7.5g，混匀。3、 用10%NaOH调节pH至5.8（用pH试纸或pH计测试），混匀。4、 在微波炉中加热至溶液均一、稳定（要补充蒸发的水）。5、 将配好的MS培养基趁热迅速分装至三角瓶或广口组培瓶中，每瓶倾倒30ml即可，盖上瓶盖（盖要松点），装入灭菌筐。6、 放入高压灭菌锅121°C，灭菌20min（整个过程约1h左右）。7、 灭菌结束后，立即拿出瓶子，趁热拧紧每个瓶盖。8、 置于组培室架子上观察3-7天，无菌落长出说明良好，供下步组培用。外植体的消毒、接种与培养二、 实验仪器与试剂1、 实验材料：新鲜胡萝卜2、 实验仪器超净工作台、酒精灯、三角瓶、培养皿、镊子、刀片、剪刀、烧杯、灭菌滤纸、纱布3、 实验试剂配制好的MS固体培养基、10%次氯酸钠、无菌水、酒精、NAA，6-BA，NaOH三、 实验操作方法（一） 外植体的消毒1、 准备工作：提前40min打开超净工作台紫外灯杀菌20min，关闭后再打开风机吹20min。坐到超净台前，将装有经湿热灭菌MS固体培养基的三角瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁。2、 外植体的消毒：选取胡萝卜的韧皮部，用水洗净。先用70%酒精浸泡15-30S，然后放入6%的次氯酸钠溶液浸泡20min，进行材料脱毒，然后用无菌水冲洗5次。（二） 外植体的切片与接种用刀片切取红色韧皮部（不含中央黄色部位）成1cm2大小方块，厚度约0.2cm。将消毒好的胡萝卜韧皮部切片，在超净工作台上用镊子接种于已灭菌的含MS固体培养基的三角瓶中，封口。注意规范操作，防止污染。（三） 外植体的初步培养将接种后的培养基三角瓶置于组培室光照培养架上，先弱光培养1周，再1000-2000lux光照培养数周，光周期为每天光照14〜16h/黑暗8〜10h。期间经常来观察，及时清除有污染者和观察外植体的变化。四、实验注意事项1、 实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；2、 材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死；3、 接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-10d的暗培养，然后再进行光照培养。实验影响因素诱导激素在许多植物品种的再生过程中，在分化培养基中添加适量的BA和NAA对分化是非常有利的，但胡萝卜愈伤组织的再生过程中BA和NAA的作用并不大，成苗非常慢，且再生频率低，而不添加任何激素的MS和B5基本培养基上，愈伤组织分化率高，且大多通过胚状体的方式成苗，这是因为胡萝卜愈伤组织和悬浮细胞系具有较强的胚胎发生能力，在无激素的培养基上容易成熟和萌发成苗。从总体看，胡萝卜愈伤组织出苗的时间相对较长，ABA可促进体细胞胚的成熟，在分化培养基中加入一定浓度的ABA是否可缩短胡萝卜愈伤组织成苗的时间，无菌操作组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。常用的物理方法有：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。常用的化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。不同的物品要选用不同的灭菌方法。实验室中常见仪器设备及其灭菌方法如下：培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下：压力在9.8*104-10.8*104Pa，灭菌温度在121°C，灭菌20-30min。玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌。塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：进入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。接种室杀菌：紫外线照射、空气消毒灭菌。超净工作台：紫外灯照射，70%-75%的酒精擦洗。外植物体灭菌：水冲洗10—20min或更长的时间一70%-75%酒精中浸泡30s-0.1%-0.2%氯化汞液中浸泡10min左右一蒸馏水冲洗4-5次一备用。.注意事项调节培养基时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。无菌操作。材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。废液处理。酒精要回收，放原处；HgCl2有剧毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放到指定位置。实验材料大小应适中，不宜太大或太小。实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及手均需严格消毒灭菌。切胡萝卜时，下面应垫上滤纸。接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意以下几点：（1） 锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；（2） 装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；（3） 增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；