蛋白质的理化性质与分离纯化

动物科技学院生物化学课程组西北农林科技大学第四节蛋白质的理化性质

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及其分离纯化蛋白质的酸碱性质和等电点蛋白质具有两性解离的性质。蛋白质的等电点是指使蛋白质所带电荷为零时溶液的pH。将盐浓度为零时的等电点，称为等离子点。它是蛋白质的特征参数。等电点的测定采用等电聚焦电泳。等电点时蛋白质的溶解度最小。分离纯化分析鉴定理化性质酸碱性质分子量胶体性质紫外吸收变性作用化学反应(1)(2)(3)12(4)3(5)(6)返回到章第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质的分子量化学组成法SDS法凝胶过滤法渗透压法沉降系数法和沉降平衡法分离纯化分析鉴定理化性质酸碱性质分子量胶体性质紫外吸收变性作用化学反应(1)(2)(3)12(4)3(5)(6)分离纯化分析鉴定理化性质酸碱性质分子量胶体性质紫外吸收变性作用化学反应第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀

蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有：①水化膜；②同种电荷的互相排斥；③布郎运动蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件，影响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。选择性沉淀蛋白质的方法：①盐析法:大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。②有机溶剂沉淀法：破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+等）结成不溶性沉淀④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。⑤加热变性沉淀。⑥等电点沉淀法(1)(2)(3)12(4)3(5)(6)第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大吸收，使得大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。分离纯化分析鉴定理化性质酸碱性质分子量胶体性质紫外吸收变性作用化学反应(1)(2)(3)12(4)3(5)(6)第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质的变性作用(denaturation)某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，称为蛋白质的变性。蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排，不涉及肽键的断裂。引起蛋白质变性的因素①物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波、机械剪切等；②化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。变性蛋白质的性质改变：①物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。蛋白质变性、沉淀与凝固变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。有些变性蛋白质在一定条件下还可以复性，是可逆变性。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。分离纯化分析鉴定理化性质酸碱性质分子量胶体性质紫外吸收变性作用化学反应(1)(2)(3)12(4)3(5)(6)第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化化学反应黄色反应，由硝酸与氨基酸的苯基（酪氨酸和苯丙氨酸）反应生成二硝基苯衍生物而显黄色。多肽的双缩脲反应：双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物。双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。分离纯化分析鉴定理化性质酸碱性质分子量胶体性质紫外吸收变性作用化学反应(1)(2)(3)12(4)3(5)(6)第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化分离纯化蛋白质的一般原则

分离和纯化蛋白质就是要增加制品的纯度或比活性。一般流程为：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存分离纯化

电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、溶解、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后蛋白质保存凝胶过滤疏水层析吸附层析1、前处理：①将组织和细胞破碎动物组织和细胞：电动捣碎机、匀浆器、超声波处理植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨、纤维素酶处理细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖）②差速离心法收集细胞的某一组分在不同离心力下沉降的细胞组分③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。2、粗分级：一般用选择性沉淀法。①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法③有机溶剂分级沉淀法④热处理选择性沉淀法⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法3、细分级：①透析除盐②sephdexG-25凝胶过滤除盐层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳离心法：密度梯度离心4、浓缩与保存浓缩方法：保存方法：①晶体保存：结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。②冻干粉保存：③溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。分析鉴定理化性质原则方法(1)(2)123第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质分离纯化常用方法的依据根据蛋白质的溶解度分离根据电荷差异分离根据分子大小分离根据配体特性异性分离选择性吸附分离（物理吸附）根据疏水性的差异分离纯化分析鉴定理化性质原则方法利用差异沉淀电泳层析离心膜分离(1)(2)123④⑤⑥①②③第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质沉淀盐溶与盐析盐溶：在较低的盐浓度下蛋白质溶解度增大的现象，称为盐溶。盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质表面的双电层，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。在分离蛋白质时通常利用盐溶促进蛋白质转移到溶液中，然后利用盐析使蛋白质从溶液中沉淀出来。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。分离纯化分析鉴定理化性质原则方法利用差异沉淀电泳层析离心膜分离蛋白质沉淀有机溶剂沉淀

与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，可使蛋白质沉淀。沉淀原理是：①脱水作用；②使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。有机溶剂分级沉淀：不同的蛋白质对于不同浓度不同比例有机溶剂的敏感度不同，所以通过改变有机溶剂的比例和浓度可以将不同的蛋白质分别沉淀出来。有机溶剂沉淀蛋白质时在低温下进行。

蛋白质沉淀等电点沉淀

不同的蛋白质有不同的等电点，蛋白质在等电点处，净电荷为零，溶解度最低。所以通过改变溶液的pH值，可以使不同等电点的蛋白质分别沉淀出来。在蛋白质盐析、有机溶剂沉淀时，通常将溶液的pH调到期等电点处。(1)(2)123④⑤⑥①②③第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质电泳在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动，这种现象称为蛋白质电泳。不同的蛋白质，等电点不同，相同pH条件下，分子所的带电荷不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。分离纯化分析鉴定理化性质原则方法利用差异沉淀电泳层析离心膜分离蛋白质电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。该电泳具有浓缩效应、分离效应和分子筛效应。

蛋白质电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）使蛋白质变性。SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合。所有蛋白质-SDS复合物为椭圆棒，短轴恒定，长轴与蛋白质分子量成比例，使电泳迁移率主要取决于蛋白质分子量。所以SDS常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。蛋白质电泳等电聚焦(IEF）电泳就是在凝胶中加入两性电解质从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。蛋白质电泳双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)电泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。(1)(2)123④⑤⑥①②③第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质层析技术层析是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。主要的层析技术有凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析及亲和层析等。分离纯化分析鉴定理化性质原则方法利用差异沉淀电泳层析离心膜分离蛋白质层析技术凝胶过滤：根据多孔载体对不同大小，形状的蛋白分子的排阻能力不同，导致其在层析柱中滞留的时间不同，分子从达到小依次先后排出，从而将各个组分分开的一种层析，又称凝胶过滤层析。应用：分离蛋白质、除盐、测蛋白质分子量通常所用的填料为：Sephadex:(交联葡聚糖)Bio-gel:(聚丙烯酰胺)蛋白质层析技术离子交换层析：根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用强弱不同而达到分离目的。分阳离子交换和阴离子交换2离子交换介质：离子交换树脂；Sepharose(交联葡聚糖)蛋白质层析技术亲和层析：利用蛋白质特异性结合进行分离。载体：Sepharose4等。空间臂：常为双功能基团，如己二氨或ε－氨基己酸。配基选择：抗原―抗体，酶―抑制剂偶联：溴化氰法,环氧氯丙烷法疏水层析，HPLC(1)(2)123④⑤⑥①②③第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质离心技术

利用蛋白质的密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比，S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大－沉降慢。应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。沉降速度法和沉降平衡法测蛋白质的分子量。密度梯度离心。分离纯化分析鉴定理化性质原则方法利用差异沉淀电泳层析离心膜分离(1)(2)123④⑤⑥①②③第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质分离中的膜技术蛋白质是高分子化合物，不能透过半透膜。将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫透析。利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。应用：除盐、浓缩分离纯化分析鉴定理化性质原则方法利用差异沉淀电泳层析离心膜分离(1)(2)123④⑤⑥①②③第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质的含量测定

1紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm有吸收。2Lowry法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产生蓝色。3Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。4凯氏定氮法5双缩脲法分离纯化分析鉴定理化性质含量纯度活性结构分析(1)(2)(3)12(4)3第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质纯度测定1电泳法：SDS－PAGE，IEF2化学法：N端测定，C端测定3仪器法：HPLC，质谱，氨基酸组成分析分离纯化分析鉴定理化性质含量纯度活性结构分析(1)(2)(3)12(4)3第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质活性测定

1激酶：标记ATP2磷酸化酶：定磷3利用靶酶活性4氧化还原酶5ELISA分离纯化分析鉴定理化性质含量纯度活性结构分析(1)(2)(3)12(4)3第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质结构分析一级结构测定

第一步：测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。分离纯化分析鉴定理化性质含量纯度活性结构分析一级空间(1)(2)(3)12(4)3①②第四节蛋白质的理化性质

及其分离纯化蛋白质空间构象分析（1）紫外光谱法（2）荧光光谱法（3）园二色性法（4）红外光谱法（5）激光拉曼光谱法（6）X－射线衍射法（7）核磁共振法分离纯化分析鉴定理化性质含量纯度活性结构分析一级空间(1)(2)(3)12(4)3①②蛋白质一级结构的测定自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。

现在一级结构测定的方法已经有了很大的改进，已经实现完全自自动化。一级结构测定概况蛋白质一级结构的测定

是研究高级结构的基础。阐明蛋白质的结构与功能的关系。为生物进化理论提供依据为人工合成蛋白质提供参考顺序。一级结构测定的意义蛋白质一级结构的测定（1）样品必需纯（>97%以上）；（2）知道蛋白质的分子