甘薯糖蛋白的分离纯化

甘薯糖蛋白的分离纯化微生物09301班第七小组程蒙董雨叶雷崔德1糖蛋白的介绍2甘薯糖蛋白的分离纯化及鉴定34内容结果分析及结论小结1908年美国生物化学家协会的蛋白质命名委员会首次将糖蛋白定义为:由蛋白质分子和除核酸外的包含有碳水化合物基团的物质共同组成的一类复合物。现已将蛋白聚糖从糖蛋白中划分出来，而专指由比较短且往往具分支的寡糖链与蛋白质(多肽链)共价相连而构成的糖复合物。一，糖蛋白的介绍甘薯糖蛋白SPG-1是一具O-型糖肽键的糖蛋白，所以其中的糖链SPG小P可在碱性条件下释放，所释放的糖链能被NaBH4场还原成对碱稳定的糖醇，而SPG-1中的蛋白质(肽链)也可部份被碱性降解为低聚肽和氨基酸其糖链也有可能被部分降解为低聚糖和单糖。SPG-1-P的一级结构是一种由葡萄糖形成的均多糖，为中性多糖。SPG-1-P主要是以α-型糖苷键连接的，糖环为毗喃型。甲基化反应证明SPG-1-P是以α-1，6-连接的葡聚糖。

糖链结构甘薯糖蛋白日本营养学家发现,甘薯含有丰富的粘液蛋白,这是一种多糖与蛋白质结合的糖蛋白,对人体有特殊的保护作用,能保持消化道、呼吸道、关节腔、膜腔的润滑和血管的弹性,由于这种物质可防止脂类物质在动脉管壁上沉积而引起的动脉硬化,防止肝及肾脏等器官结缔组织的萎缩,可以减缓人体器官的老化,提高肌体免疫力。日本国力癌症预防研究所通过实验证明,甘薯的抗癌效果在各种蔬菜中位居第1。我国是世界上甘薯生产第1大国,在甘薯淀粉生产过程中会产生大量的废液，这其中就含有大量的甘薯糖蛋白。甘薯糖蛋白的组成甘薯粗糖蛋白经过(NH4)2SO4分级沉淀和柱层析分离,得到SP-324组分,组成分析结果表明氨基酸组成中天冬氨酸含量最高,占总氨基酸总量的13.80%,能够构成O-糖肽键的丝氨酸和苏氨酸分别占总量的6.05%和4.89%;其单糖主要含有葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖,其比例为12∶1∶1.14,并含有痕量的鼠李糖、木糖、甘露糖;SP-324组分是一种糖蛋白，其中蛋白含量74.00%,糖含量7.80%,而且SP-324组分中的糖和蛋白是以O-糖肽键连接到苏氨酸上的甘薯糖蛋白的利用（１）国外甘薯食品的开发利用现状目前，国外的甘薯食品有：

方便食品、快餐食品、方便半成品，如薯米(粒)、薯粉、薯面、脱水薯片(条、泥)；

休闲食品，如膨化薯片、薯脯等，这类食品具有味美、食用方便、包装精美等特点；

其他，如甘薯饮料、甘薯罐头、甘薯酒等i引。近年来，国外一些地区掀起了一阵甘薯食品热，一些较大的食品厂竟相丌发甘薯食品，使这种普通的甘薯成为人们喜好的新潮食品。目前它己被制作成山芋饼、小甜饼、果子冻、冰淇淋、果子露，甘薯酸奶等多种保健食品和美容食品。（２）国内甘薯食品的开发利用现状国内利用甘薯加工的食品有：甘薯脯、甘薯蜜饯、甘薯酱、薯糕、软糖、罐头、粉丝、粉条、粉皮、甘薯粉、多维面条、煎饼、雪糕、巧克力、膨化食品、脱水甘薯片、虾味脆片、速煮甘薯、冷冻甘薯片、连城红心薯干、香酥薯片、甘薯发糕、甘薯点心、甘薯黄酒掣。目前，香港己流行用甘薯叶制作名宴菜，菜市出售每kg甘薯叶价超过100港元，且货源奇缺，经常脱销。用甘薯叶加工成的脱水菜、盐渍菜，在日本、欧美、东南亚等地市场非常畅销。我国福建省的永定、新罗、安溪、永春等地及广东省一些地区，也常以甘薯叶作为夏季蔬菜。甘薯叶食用方法简单，取幼嫩的叶片与叶柄(撕去表皮)，经开水烫熟后，佐以香油等调料即可入肴，也可加调料爆炒。二，甘薯糖蛋白的分离纯化及鉴定1.材料和仪器材料：甘薯、DEAE-52纤维素、SephadexG-100、无水乙醇、Sevag试剂（氯仿、正丁醇）、碳酸氢钠溶液、0.02mol/LTris-HCl、透析袋、牛血清白蛋白标准液、葡萄糖标准液、Folin-酚试剂、硫酸-苯酚试剂、正丙醇、浓氨水、水、0.5%甲苯胺蓝乙醇溶液、考马斯亮蓝R250、Tris-Gly-SDS溶液等仪器：紫外可见分光光度计、SDS-PACE电泳仪、自动部分收集器、冷冻真空干燥器、离心机、层析系统、ZK-82A真空干燥箱2.甘薯粗糖蛋白提取的工艺路线为：

甘薯粉一热水浸提一抽滤得到浸提液一浸提液真空浓缩一醇析过夜一离心弃上清一少量水溶解一Sevag法去除游离蛋白一离心一取水层透析一透析内液醇析过夜一离心一沉淀真空干燥一甘薯粗糖蛋白，3.分离和纯化的操作步骤(1)称取的甘薯在60℃下烘干并粉碎，加适量（4～6倍）水浸取3次，每次0.5～1h。(2)合并浸取液，离心，上清液加无水乙醇沉淀蛋白，离心后分离出沉淀。(3)所得沉淀物用适量蒸馏水溶解，再加入氯仿：正丁醇=4:1(V/V）的Sevag试剂，以充分去除脂质、游离蛋白质，然后样液取水层透析，收集透析袋内液，离心（4500r/min）30min，取上清液，真空干燥后即得甘薯糖蛋白粗品（淡黄色粉末）(4)甘薯糖蛋白粗品依次经DEAE-纤维素52柱层析(1.6cmx20cm)，分别用0.05,0.1,0.5mol/L的碳酸氢钠溶液分阶段洗脱，收集洗脱液。(5)洗脱液在经过SephadexG-100柱层析(1.6cmx80cm),用0.02mol/LTris-HCL(pH7.2)洗脱，收集洗脱液X

4甘薯糖蛋白纯度的鉴定(1)纸色谱对甘薯糖蛋白的纯度鉴定经DEAE-52和SephadexG-100柱层析的甘薯糖蛋白纯品物质,溶解于一定体积水后点样进行纸色谱，经大量预备实验，确定出较好的展开剂为正丙醇：浓氨水：水=40：60：5,显色剂为0．5％甲苯胺蓝乙醇溶液。层析结果可以看出，经DEAE-52和SephadexG-100柱层析精制后的甘薯糖蛋白纯品仅出现一个斑点，Rf值为0．64，而洗脱前的甘薯糖蛋白粗品在原点处尚有一个斑点。(2)SDS一聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)电泳对甘薯糖蛋白的纯度鉴定甘薯糖蛋白粗品和经DEAE-52柱层析、SephadexG-100柱层析后的甘薯糖蛋白纯品同时进行SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳，分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为6％，电极缓冲液为pH8．3的Tris—Gly—SDS溶液，用考马斯亮兰R250染色，脱色液为7％冰乙酸。实验发现如图１、图２，甘薯糖蛋白粗品经电泳后，有两条染色带，而甘薯糖蛋白纯品只有唯一的一条带，可以证明甘薯糖蛋白纯品已经得到纯化。图１甘薯糖蛋白粗品

图２甘薯糖蛋白纯品

SDS—PAGE电泳图

SDS—PAGE电泳图

５甘薯糖蛋白含量的测定甘薯糖蛋白以苯酚一硫酸法测定其糖含量，以葡萄糖为标准品；以F01in一酚试剂法测定其蛋白质含量，以牛血清清蛋白为标准品，经280nm和490nm下分别比色测定，按上述提取纯化流程1009鲜甘薯(重复三次)，经溶剂提取得到甘薯糖蛋白粗品，干燥至恒重为0．47119，得率为0．47％，再经DEAE一52和SephadexG—100柱层析后的甘薯糖蛋白纯品，干燥至恒重为O．38569甘薯糖蛋白纯品，得率为0．39％。三、结果分析及结论１．甘薯糖蛋白提取料液比及时间的确定２．甘薯糖蛋白提取沉淀试剂的选择３．透析对甘薯糖蛋白提取率的影响４．甘薯糖蛋白的纯化５．结论从图可以看出，随溶剂体积的增加和提取时间的延长，提取率逐渐增大。当提取溶剂大于6倍样品体积和提取时间大于lh后，提取率