枯草芽孢杆菌黑色变种超氧化物歧化酶活性测定的影响因素

枯草芽孢杆菌黑色变种超氧化物歧化酶活性测定的影响因素

超氧化物酪氨酸酶（sod）是一种具有特定生物内标记异体基的氧化酶。这是唯一以o2为基础的酶。2'反应可渗透2'o8-，生成b2和b2o。随着超氧化物歧化酶研究的不断深入和辐射防护生物学的不断发展,对超氧化物歧化酶的研究也越来越多。SOD属酸性蛋白酶,对pH值、热和蛋白酶水解等比一般酶稳定,但是其活性和催化效率与其含量和所处环境的理化因素有关。近几年来对SOD稳定性的研究有了很大的进展,出现了对SOD的分子改造和化学修饰。对SOD的分子改造与修饰,改变了分子的物理化学性质,增加了SOD对高温和极端pH值等的稳定性。但是在研究外界胁迫对细胞内源性SOD活性的影响时,往往存在环境因素对其活性的影响,降低了研究结果的可信度。因此,本课题从酶液以及菌液的制备、保存温度、保存方式、保存时间等方面分析了SOD活性测定中的影响因素,从而为研究SOD活性的测定提供参考。1材料和方法1.1菌株的保藏中心枯草芽孢杆菌黑色变种(Bacillussubtilisvar.niger,ATCC9372),购于中国普通微生物菌种保藏中心。1.2细胞破碎条件对sod活性的测定营养琼脂培养基(NA培养基:蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,水1000mL培养菌体,37℃,160rpm振荡培养菌体16h,作为种子液。按10%比例将种子液重新接入培养基,37℃,160rpm振荡培养12h,得到菌液。酶标仪(ThermoFisherScientificInc1500~417)测定其在600nm处的吸光度,记录OD600。将菌液平均分成2份(记为A、B),A样品考察细胞破碎条件对SOD活性测定的影响;B样品考察不同保存条件(样品保存形式、保存时间、保存温度)对SOD活性的影响。1.3超声时间对sod活性的影响将上述A样品4℃,5000rpm×10min离心收集菌体,等体积溶菌酶液(4mg/mL)复溶分装,37℃恒温分别放置30min和40min,分别用不同超声时间处理(10min、15min、20min、25min、30min),显微镜检观察破碎情况,并测定SOD活性,选择出对酶活性影响最小的细胞破碎条件。1.4样品保存1.4.1酶液制备方法将上述B样品分成2个部分(B1和B2),B1分装于EP管后直接保存于4℃、-20℃、-70℃冰箱,分别在不同时间取出测定SOD活性。此样品定义为菌液样品。将B2样品5000rpm×10min,4℃冷冻离心,收集菌体。用0.03mol/LpH7.2PBS(无水磷酸氢二钠2.83g,磷酸二氢钾1.36g,蒸馏水1000mL洗涤1次,37℃溶菌酶处理后超声破碎。超声破碎后的样品1000rpm×10min,4℃冷冻离心,收集上清液酶液。酶液分装于EP管后分别保存于不同温度(保存条件同B1),不同时间取出测定SOD活性。此样品定义为酶液样品。1.4.2不同的h和多次保存时间对其酶活的影响不同温度下保存的菌液样品和酶液样品分别考察短时间保存(0h、4h、8h、12h、16h及24h)和长时间保存(1d、3d、5d、10d、15d、20d及50d)对其酶活的影响。分别在预定的时间取出B1、B2,测定SOD活性,分析不同保存条件对酶活测定的影响。1.5黄系a型抗氧化酶活性测定SOD活性测定选用用超氧化物歧化酶(SOD)测试盒,该试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,酶标仪测定550nm处的吸光值。酶活性定义为每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。2结果与分析2.1不同超声时间对枯草芽孢杆菌sod活性的影响采用显微镜镜检的方法对比研究了溶菌酶处理30min和40min,超声波分别处理10min、15min、20min、25min、30min时,细胞破碎的情况。镜检发现,当溶菌酶处理30min,细胞破碎程度随着超声时间的增长而加大,超声处理10min时约70%破碎,处理20min时约80%,处理30min时细胞基本破碎;当溶菌酶处理40min,随着超声时间的增长,细胞碎片增多,而且细胞碎片较30min处理时纷杂,超声25min、30min时碎片粘连。用溶菌酶37℃温育30min或40min,再超声处理不同时间(10min、15min、20min、25min、30min)后的SOD活性显示,溶菌酶处理30min时,随着超声时间的增长,SOD活性呈先升高后降低的趋势变化,超声时间为25min时,酶活达到峰值,随着超声时间的继续增大,酶活降低(见图1);溶菌酶处理40min时,SOD活性随着超声时间呈不规律变化。超声时间较短时,SOD活性较处理30min时高,但此时镜检结果表明细胞未完全破碎;超声时间增长时,SOD酶活反而低,即处理40min时,超声处理对SOD活性产生了负影响。实验结果表明,采用溶菌酶处理枯草芽孢杆菌黑色变种,作用40min下的细胞破碎程度较30min高,但对SOD活性的影响较大;溶菌酶处理30min,细胞破碎相对完全,对SOD活性影响小;综上所述,选用溶菌酶30min并以超声25min处理对SOD活性影响最小,本研究后续所有酶样品制备均选择该参数。2.2不同保存方式对样品sod活性的影响图2显示的是酶液样品在24h内SOD活性变化的曲线。从图中可以看出,在24h内,SOD活性随着时间的增长而不断下降。保存温度对SOD的活性也有明显影响。在4h内,以4℃保存酶液最佳,其SOD酶活性基本无变化。在8h后,-70℃保存下的酶液酶活性最大,在24h时其活性保留了88.87%。图3显示的是以菌液形式保存的样品在24h内SOD活性随时间变化的曲线。从图中可以看出,在8h内,不同温度保存下的菌体SOD活性都有一定程度的增加,在8h时-70℃保存的酶活最高,酶活值上了6.94%。随着时间的继续增大,SOD活性开始下降,在24h后降到原酶活性的77.19%。由图可知菌液样品的SOD活性在短时间内呈现先升高后降低的趋势。这可能是由于菌液样品在低温环境下首先自我调节适应环境,相较之下4℃诱导菌液分泌更多的SOD来抵御逆境。由图2和图3,可以得出这样的结论:短时间内保存时间、保存温度和保存样品形式对SOD活性有显著的影响。在4h内,以菌液形式保存于4℃下的样品SOD酶活性最高;4~16h里,以菌液形式保存于-70℃下的样品SOD酶活性最高;16~24h中,以酶液形式保存于-70℃下的样品SOD酶活性最高。根据SPSS统计分析表明,菌液及酶液2种保存方式在短时间内的结果差异极显著,p<0.01;3种保存温度间差异也都极显著,p<0.01。2.3不同保存温度对sod活性的影响图4和图5分别是酶液形式和菌液样品在长时间保存下SOD活性随时间变化的曲线。从图中可以看出,2种形式的样品SOD活性均随保存时间的增长呈下降趋势。尤其在20d以后,酶活下降程度很大。不同保存温度下的SOD活性也不同,保存温度越低SOD活性越高。酶液样品-70℃下保存,3d内SOD酶活性下降相对较小,3d时能保留85.62%的酶活性;菌液样品的SOD活性下降相对高。由上述2个图可以得出结论:酶液样品保存于-70℃时SOD酶活性最高,即外部因素对其影响最小。菌液和酶液样品长时间保存,SOD活性均不断下降,在相同保存温度下,酶液样品的SOD活性比菌液样品高,但2种样品的SOD活性在保存20d后均急速下降,保存得温度越低SOD活性相对越高。究其原因可能是:酶液样的SOD活性只受到时间和温度的影响,而菌液样品受到环境影响刺激后,细胞会调节自身做出不同的响应,导致SOD活性变化与酶液样品不一致。综上所述,保存时间和保存温度均对SOD活性有影响,制成酶液后保存于较低温度下,对其影响相对较小。通过SPSS统计分析表明,2种形式长期保存下,检测时间之间差异都极显著,p<0.01;3种保存温度间差异也都极显著,p<0.01。3不同保存方式对sod活性的影响细菌的细胞壁几乎都是由肽聚糖(peptidoglycan)组成,细菌细胞破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。目前已发展了多种细胞破碎的方法,以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。超声破碎和酶溶法是目前实验室最常见的细胞破碎方法。传统的超声破碎法是采用超声波振荡器发射的15~25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。此法每次只能处理一个样品,在少量样品时操作简便,液量损失少,当样品量相对较多时比较费时;另外超声波直接与细胞接触,产生的化学自由基团可能使某些敏感性活性物质变性失活,且样品散热有困难,处理后的样品常有黑色沉淀。超声波能改变蛋白质的进空间结构,随着超声次数的增大引起蛋白质活性的降低。由于本研究要考察酶活,因此本研究采用溶菌酶处理和超声破碎相结合的方法,使细胞破碎程度相对较高,且将外界对SOD活性影响降到最低。本研究超声清洗机代替超声细胞破碎仪,不但避免了超声波与细胞的直接接触,降低超声波对酶活的影响,还可以成批处理样品,操作更简便。刘红等曾采用酶解—超声法破碎大肠杆菌提纯包含体,优化提纯包含体的条件,结果证实此方法可获得纯度更高的包含体。李兰等对比研究了4种破壁方式对细菌产SOD活性的影响,发现助溶剂破壁处理下得到的SOD活性最高。SOD是一种活性蛋白质。因此,一切对蛋白质活性有影响的因素都会影响酶的活性。周佳敏等指出,SOD与溶液微环境变化呈相关性。酶与底物作用的活性,受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响;另外,酶样品的保存也会对酶活测定造成影响。本研究考察了保存形式(酶液、菌液)、保存时间和保存温度对SOD活性的